СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ СОСТАВОВ НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЙ С ФЕНОЛЬНОЙ СТРУКТУРОЙ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/78 A61K31/19 A61K31/195 

Изобретение касается способов повышения активности биологически активных веществ растительного происхождения с фенольной структурой и может использоваться в области медицины, ветеринарии, косметологии и пищевой промышленности.

Многие фенольные соединения обладают биологической активностью /1, 2, 3, 4, 5/. Ряд фенольных соединений являются природными веществами, они в значительных количествах накапливаются в различных растениях /6, 7, 8, 9/. К наиболее часто встречающимся в природе относятся тимол (из тимьяна), карвакрол (из душицы), хавикол (из лавра), пирокатехины (как часть дубильных веществ), флаваниды (из шлемника). Известно медицинское, пищевое, косметическое применение фенолсодержащих растений, их экстрактов и индивидуальных фенольных соединений, выделенных из них /10, 11, 12/. Например: арбутин (из толокнянки) используется как диуретик, салицин (из ивы) - как антипиретик, рутин и кверцетин (из руты, гречихи) - как гипотензивное, тимол (из тимьяна), ментол (из мяты), плоды тмина используются как вкусовые и ароматические вещества (добавки) в пищевой промышленности, эксракт алоэ входит в состав косметических кремов и т.д. К наиболее широко известным растениям, содержащим активные фенольные соединения относятся женьшень /4/, чайный куст /2/, оливковое дерево /1/, а также, часто встречающиеся в Восточной медицине и получающие все большее распространение у нас, растения бадан и шлемник байкальский /9/, расторопша пятнистая /11/.

Шлемник байкальский (Scutellaria Baicalensis Georgy) - многолетнее травянистое растение семейства Labiatae (Lamiaceae). Содержит ряд биологически активных веществ: флавоноиды (байкалин, байкалеин, вогонин, скутеллярин), больше количество пирокатехинов, крахмал, дубильные вещества и другие органические соединения /5/. Препарат шлемника байкальского широко употребляется в народной медицине, занимая четвертое место по частоте упоминания в рецептуре /5/.

Известно, что экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) в дозах 50-300 мг/кг на крысах и мышах проявляет биологическую активность, обладает умеренным противоопухолевым и выраженным противометастатическим действием, стимулирует гемопоэз /5/, оказывает антигипоксическое действие /13/. В сухом ЭШБ содержится сумма фенольных соединений, основную массу которых составляют флавоноиды байкалин и вогонин (30% и 10% соответственно) /14/. Флавоноид шлемника байкалин биологически активен в дозах 10 - 100 мг/кг на крысах и мышах /13/.

Бадан толстолистный (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch) - многолетнее травянистое растение семейства камнеломковые Saxifragaceae. Листья содержат ряд биологически активных веществ: флавоноиды (4-30 мг/г) бергенин, кверцетин, кемпферол, лейкоантоцианиды, большое количество катехинов, витамин С (от 45-60 до 260 мг%), дубильные вещества и другие органические соединения /9/. Известны его психостимулирующие /15/ и антигипоксические /16/ свойства.

Расторопша пятнистая (Silybum marianum L. ) - одно - либо двухлетнее травянистое растение, произрастающее в Средиземноморье, южных районах Европы /11/. В официнальном экстракте расторопши, известном под коммерческими названиями Легален, Карсил и т.д., содержится на 90 мг экстракта 70 мг фенольных соединений - флавоноидов (силибинин, силикристин, силидианин), из которых силибинина - 30 мг /12/.

Как следует из изложенного выше, фенольные соединения природного происхождения широко распространены, находят разностороннее применение и поэтому проблема поиска путей повышения их активности представляется весьма актуальной.

Известен способ повышения активности гидрофобного фенольного комплекса прополиса (продукта природного происхождения) путем его комбинации с твином-80 и эфирными маслами /33/. Однако данный способ имеет ограниченное применение. Задачей, решаемой настоящим изобретением, является повышение биологической активности различных фенольной соединений.

Указанная задача достигается тем, что фенольные соединения растительного происхождения, отдельно выделенные, или в виде экстрактов комбинируют с соединениями, выбранными из группы, включающей дикарбоновые кислоты, их соли, аминокислоты, их соли, витамины или смеси указанных веществ. Фенольные соединения и вещества, потенциирующие их действие, могут использоваться либо в виде смеси, либо отдельно при последовательном или одновременном введении. При этом комбинируемые вещества могут вводится в организм человека или животного с целевыми добавками.

В проанализированной литературе не выявлено источников, описывающих данную совокупность отличительных признаков, и предлагаемое техническое решение явным образом не следует для специалиста из уровня техники, таким образом, оно соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень". Предлагаемое изобретение можно использовать в клинической медицине, косметологии, пищевой промышленности. Таким образом, оно соответствует критерию изобретения "промышленно применимо".

В качестве соединений, усиливающих активность составов на основе соединений с фенольной структурой, могут использоваться различные дикарбоновые кислоты, преимущественно янтарная кислота, яблочная, фумаровая, или их соли, такие как соли натрий, калия, лития, железа, аммония, и/или аминокислоты или их соли, преимущественно глутаминовая кислота, глицин, и/или витамины, например, аскорбиновая кислота (C), пиридоксина гидрохлорид (B₆) и др. В зависимости от назначения состава в него могут вводится различные целевые добавки: фармацевтически приемлемые носители, такие как растворители, наполнители, ПАВ, масла; косметически приемлемые носители; минеральные, вкусовые и другие пищевые добавки.

Потенцирующие активность соединения вводят в эффективных количествах, в зависимости от назначения состава (лечебное, профилактическое, общеукрепляющее), вида соединения Так, суточная доза витамина B₁₂ составляет несколько микрограмм, в лечебных целях - 30-50 мкг; витамин C в профилактических целях назначают в дозах 50-100 мкг, а в пищевую добавку вводят в дозе до 2,5 г и т. д. ; кислоты преимущественно вводят в количестве, составляющем в среднем 20-500 мг, при необходимости - до нескольких грамм.

Состав на основе фенольного соединения может представлять собой лекарственное средство в форме удобной для приема, в виде таблеток, капсул, растворов, суспензий, мазей, настоев, порошков и т.д., при использовании в ветеринарии в виде гранул, болюсов, кормовых добавок. Состав может представлять собой косметическое средство, такое как крем, зубная паста. Он может представлять собой пищевую добавку или напиток.

Для доказательства получения заявленного технического результата ниже приводятся примеры соответствующих испытаний. Приведенные примеры иллюстрируют, но ни в коей мере не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Антигипоксическое действие. В работе использована модель нормобарической гиперкапнической гипоксии. Исследовали действие экстракта шлемника байкальского (ЭШБ), экстракта расторопши пятнистой (ЭРП), экстракта бадана толстолистного (ЭБТ), байкалина, силибинина, кверцетина, а также их смеси с янтарной кислотой (ЯК) и ее солями, яблочной кислотой (ЯБЛ), глутаминовой кислотой (ГЛУ), глицином (ГЛИ), витаминами С и
Исследование проводили на белых беспородных мышах - самцах массой 18,0-22,0 грамма. Гипоксию моделировали, помещая животное в герметично замкнутый сосуд объемом 0,2л (гипоксия гермообъема); фиксировали время до наступления агональных явлений.

Исследуемые препараты вводили перед опытом в виде взвеси в 1% крахмальной слизи в течение 5 дней 1 раз в день зондом внутрижелудочно. Контрольная группа получала эквиобъемное количество крахмальной слизи. Дозы препаратов составляли: ЭШБ - 150 мг/кг /13/, ЭБТ - 100 мг/кг /15/, ЭРП - 100 мг/кг /17, 18/, байкалин - 50 мг/кг /13/, кверцетин - 50 мг/кг /19/, силибинин - 50 мг/кг /20/. Дикарбоновые и аминокислоты, а также витамины вводили в биологически активных дозах; ЯК в дозах 10, 50, 100 и 300 мг/кг, соли ЯК - в дозах 100 мг/кг/21/, ЯБЛ - 10 и 100 мг/кг /22/, ГЛУ - 10 и 100 мг/кг /23/, ГЛИ - 10 и 100 мг/кг /24, 25/, витамин C - 10 и 100 мг/кг /26/, витамин B₆ - 2 и 20 мг/кг /27/.

Полученные результаты представлены в табл. 1, 2, приведенных в конце текста.

Судя по полученным результатам, растительные экстракты шлемника байкальского, бадана толстолистного и расторопши пятнистой так же, как и отдельное соединение флавоноидной структуры, входящее в состав экстрактов, - байкалин, кверцетин, силибинин, оказывают антигипоксическое действие. Янтарная кислота и ее соли, яблочная кислота, глутаминовай кислота, глицин, витамины C и B₆, не оказывая самостоятельного антигипоксического действия на данной модели патологии, усиливают антигипоксическое действие соединений фенольной структуры.

Пример 2. Гепатопротекторное действие. Исследованы официнальные препараты - экстракт расторопши пятнистой (ЭРП), содержащий смесь флавоноидов силибинина, силидианина и силикристина, сам силибинин, катерген (природный флавоноид, содержащийся в растении Gambir) /17, 18/, дикверцетин - фенольное соединение флавоноидной структуры, выделенное из лиственницы сибирской и даурской (Larix Sibirica, Larix Dahurica) /32/, а также их смесь с ЯК и некоторыми ее фармацевтически приемлемыми солями (натриевой, калиевой, диаммонийной), с ЯБЛ, ГЛУ, ГЛИ, витаминами C и B₆. Препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде взвеси в 1% крахмальной слизи. В опыте использованы белые беспородные крысы - самцы массой 200 - 220 г. Гепатопротекторное действие исследуемых препаратов изучали по способности предохранять повреждение печени четыреххлористым углеродом (CCl₄); выраженность защитного действия оценивали по снижению продолжительности сна животных после введения гексенала /28/. Исследуемые препараты вводили животным 1 раз в день в течение 7 дней. После 3-х дней введения препаратов животным, на фоне введения исследуемых препаратов, начинали вводить в течение 4-х дней CCl₄. Токсический агент вводили также зондом внутрижелудочно в дозе 1,25 мл/кг в виде 50%-ного раствора в растительном масле; контрольные животные получали эквиобъемное количество растительного масла. На следующий день после одновременного завершения введения исследуемых препаратов и CCl₄ у животных оценивали продолжительность сна, вызванного гексеналом. Гексенал вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг.

Судя по полученным результатам, ЯК и ее фармакологически приемлемые соли, так же как ЯБЛ, ГЛУ, ГЛИ, витамины C и B₆, не оказывая на данной модели патологии гепатопротекторного действия, усиливают способность ЭРП, силибинина, катергена и дикверцетина защищать печень от токсического повреждения CCl₄.

Полученные результаты представлены в табл. 3, 4, помещенных в конце текста.

Пример 3. Церебропротекторное действие. Исследовали действие ЯК, ЯБЛ, ГЛУ, ГЛИ, витаминов C и B₆ на способность фенольных соединений - рутина, кверцетина и силибинина ограничивать развитие спонтанного перекисного окисления липидов в митохондриях головного мозга крыс, перенесших двустороннюю окклюзии сонных артерий. В опытах использованы белые крысы - самцы линии Вистар. Исследуемые препараты вводили 1 раз в день зондом внутрижелудочно в течение 5 дней в виде взвеси в 1% крахмальной слизи. Контрольная группа получала эквиобъемное количество крахмала. На 6 сутки животных оперировали под эфирным наркозом (перевязка обеих сонных артерий). Через 3 часа после операции крыс декапитировали, извлекали головной мозг и промывали его охлажденной до 0^oС среде выделения, содержащей 120 мМ KCl, 2 mM Трис-буфера (pH 7,4). Затем по общепринятой методике /29/ выделяли грубую митохондриальную фракцию, которую разводили средой выделений до концентрации белка 1 мг/мл. Спонтанное ПОЛ регистрировали в среде, идентичной среде выделения /30/. Среду, содержащую 1 мг/мл белка MX, для оценки спонтанного ПОЛ инкубировали в водяной бане при 37^oC, периодически встряхивая. На 0, 15,30 и 60-й минуте инкубации отбирали пробы среды (по 2 мл), смешивали их с 2 мл холодной 30% трихлоруксусной кислоты и 2 мл 0,75%-ного раствора тиобарбитуровой кислоты. Смесь нагревали 15 мин в кипящей водяной бане и центрфугировали 15 мин при 3000g. Количество образовавшегося МДА определяли по оптической плотности надосадочной жидкости при 532 нм. Результаты выражали в пересчете на коэффициент молярной экстинкции в нмоль/мг белка. Содержание белка определяли методом Lowry /31/.

Судя по результатам исследований, ЯК, МАЛ, ГЛУ, ГЛИ, витамины C и B₆ на используемой модели эксперимента не оказывали церебропротекторного действия, не влияя на накопление продуктов перекисного окисления липидов в митохондриях головного мозга, но усиливали церебропротекторное действие исследуемых фенольных соединений.

Полученные результаты представлены также на чертежах 1 - 3, размещенных в конце текста.

Таким образом, приведенные данные показали, что дикарбоновые кислоты либо аминокислоты, либо их соли, а также витамины, применяемые в биологически активных дозах в комбинации с веществами фенольной структуры, усиливают активность последних.

Источники информации
1. Manna С. et al. The protective effect of the olive oil polyphenol (3,4-dihydroxyphenyl)-ethanol counteracts reactive oxygen metabolite-induced cytotoxicity in Caco-2 cells // J Nutr, 1997 Feb, 127:2, 286-92.

2. Miyagawa С. et al. Protective effect of green tea extract and tea polyphenols against the cytotoxicity of 1,4-naphthoquinone in isolated rat hepatocytes // Biosci Biotechnol Biochem, 1997 Nov, 61:11, 1901-5.

3. Stoner G. et al. Polyphenols as cancer chemopreventive agents // J Cell Biochem Suppi, 1995, 22:, 169-80.

4. Chen S. et al. American ginseng. II. Analysis of ginsenosides and their sapogenins in biological fluids // J Nat Prod, 1980 Jul-Aug, 43:4, 463-6.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М. с соавт. Шлемник байкальский. Томск, 1994. - 223с.

6. Харборн Дж. Биохимия фенольных соединений. М.: Мир, 1968. - 451 с.

7. Запрометов Н.М. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа, 1974. - 214 с.

8. Котуков Г.Н. Культивируемые и дикорастущие лекарственные растения - Киев, 1974. - 175 с.

9. Лекарственные растения Сибири / Под ред А.В. Положий и Е.Д. Гольдберг. - Томск, 1995. - 325 с.

10. Асеева Т.А., Найдакова Ц.А. Пищевые растения в тибетской медицине - Улан-Удэ, 1983. - 144 с.

11. Йорданов Д. и др. Фитотерапия - София, 1973. - 439с.

12. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1998, - Т. 1. - С. 514-515.

13. Сайфутдинов P. P. Влияние шлемника байкальского на энергетический метаболизм головного мозга крыс при гипоксии: Автореф. дисс.канд. мед. наук. Томск, 1997. 23 с.

14. Литвиненко В. И., Попова Т.П. Флавоноиды глюкурониды // Тез. докл. 3-го съезда фармацевтов Туркменской CCP. Ашхабад, 1989. С. 165-166.

15. Автор, свид. AC 1797198, Б.И. Способ получения экстракта, обладающего психостимулирующими свойствами (бадан).

16. Смирнова Н.Б., Хазанов В.А. Церебропротекторное действие экстракта листа бадана толстолистного // Тез. докл. Всероссийской конференции "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". М.: БЭБиМ, 1997. С. 113.

17. Favari L; Perez A. Comparative effects of colchicine and silymarin on CC14-chronic liver damage in rats // Arch Med Res, 1997 Spr, 28:1, 11-7.

18. Skottova N; Krecrnan V. Dietary silymarin improves removal of low density lipoproteins by the perfused rat liver // Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med, 1998, 141:, 39-40.

19. da Silva E. Et aL Quercetin metabolites inhibit copper ion-induced lipid peroxidation in rat, plasma // FEBS Lett, 1998 Jul 3, 430:3, 405-8.

20. Gaedeke J; et al. Cisplatin nephrotoxicity and protection by silibinin // Nephrol Dial Transplant, 1996 Jan, 11:1, 55-62.

21. Терапевтическое действие янтарной кислоты / Под ред. М.Н. Кондрашовой. - Пущино, 1976. 126 с.

22. Ueda Н. Et al. Reduction of cisplatin toxicity and lethality by sodium malate in mice // Biol Pharm Bull, 1998 Jan, 21:1, 34-43.

23. Boyle FM; Wheeler HR; Shenfield GM Glutamate ameliorates experimental vincristine neuropathy // J Pharmacol Exp Ther, 1996 Oct, 279:1, 410-5.

24. Sheveleva GA. et all. The corrective properties of glycine in alcoholic intoxication in the fetal period of pregnancy // Eksp Klin Farmakol, 1996 Jan, 59:1, 27-9.

25. Zhang W. B., Hahn R.G. Double toxicity' of glycine solution in the mouse // Br J Urol, 1996 Feb, 77:2, 203-6.

26. Siman С.М.; Eriksson U.J. Vitamin С supplementation of the maternal diet reduces the rate of malformation in the offspring of diabetic rats // Diabetologia, 1997 Dee, 40:12, 1416-24.

27. Roth Maier D.A., Benedikt J., Kirchgessner M. The effect of alimentary vitamin B₆ supply during pregnancy and lactation on the activity of specific transaminases of lactating rats // Z Ernahrungswiss, 1996 Sep, 35: 3, 282-7.

28. Гацура В.В., Саратиков А.С. Фармакологические агенты в экспериментальной медицине и биологии. Томск, 1977, 155 с.

29. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / Под ред. Франка Г.М. - M.: Наука, 1973. 224 с.

30. Осинская Л.Ф., Чумаков В.Н. Сравнительная характеристика митохондриального и микросомального НАД(Ф)Н-зависимого переокисления липидов // Биохимия. - 1980. - Т. 45. - Вып. 2. - C. 217-227.

31. Lowry O.H. et al. Protein measurement with Folin phenol reagent // Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275.

32. Tiukavkina N.A. et al. Dihydroquercetin-a new antioxidant and biologically active food additive // Vopr Pitan, 1997, v. 6, 12-5.

33. SU 1264946, A 61 K 35/78, БИ N 39, 1986 г.

Изобретение относится к медицине, косметологии и пищевой промышленности. Способ повышения активности биологически активных веществ фенольного характера заключается в комбинированном введении указанных веществ с дискарбоновыми кислотами, и/или аминокислотами, и/или витаминами. Предложенный способ более эффективен. 1 с. и 6 з.п.ф-лы, 4 табл., 3 ил.

1. Способ повышения активности состава, содержащего по крайней мере одно биологически активное соединение растительного происхождения с фенольной структурой и/или экстракт на его основе, и, в случае необходимости, целевую добавку, отличающийся тем, что состав вводят в виде комбинации для одновременного или последовательного применения с соединением, выбранным из группы, включающей дикарбоновые кислоты, их соли, аминокислоты, их соли, витамины и смеси указанных соединений. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что комбинация для одновременного применения представляет собой смесь указанных соединений. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой лекарственное средство. 4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой пищевую добавку. 5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой лечебный напиток. 6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой косметическое средство. 7. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что соединение с фенольной структурой представляет собой флавоноид или кумарин.