СПОСОБ ПРОГНОЗА РАННИХ РЕЦИДИВОВ РОЖИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, и может найти применение для прогноза развития ранних рецидивов рожистого воспаления.

Рожа остается одной из наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека (В. Л. Черкасов. Рожа - Медицина, 1986). Характерной чертой современного течения рожистого воспаления является его частое рецидивирование, что свидетельствует о неполном освобождении макроорганизма от возбудителя. Ранний и точный прогноз этого состояния представляется весьма актуальным, поскольку позволяет своевременно вносить соответствующие коррективы в терапию больных рожей.

В научной и патентной литературе последних лет имеются сведения о довольно большом числе способов прогноза у больных рожистым воспалением ранних рецидивов заболевания. Так, В.Н. Жидких (Прогнозирование рецидивов и комплексная терапия больных рожей нижних конечностей: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Луганск, 1991. - 18 с.) разработан "Способ прогнозирования ранних рецидивов у больных рожей нижних конечностей, базирующийся на результатах исследований регионального кровотока методом тетрополярной реографии. Автором получены данные, позволяющие прогнозировать при снижении в периоде клинической реконваленсенции заболевания относительного объема пульса менее 0,40 и объемной скорости кровотока менее 2,5 мл/мин/100 см развитие ранних рецидивов рожи нижних конечностей с вероятностью 94 ± 3%.

К сожалению, предложенный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, его можно применить только в периоде клинического выздоровления (перед выпиской больных из стационаров), а следовательно, для раннего прогноза он неприемлем; во-вторых, он пригоден лишь для больных рожей нижних конечностей, которые составляют не более 60% страдающих этим заболеванием; и, в-третьих, автором не приводятся конкретные данные об информативности, специфичности, точности и ожидаемой ценности предложенного способа, без чего показатель вероятности, приведенный автором, теряет практический смысл.

Известен также способ прогноза рецидивирующего течения рожи, основанный на определении HLA-фенотипов у лиц, страдающих этим заболеванием (патент N1458826 (РФ) /Левина Л.Д. с соавт. Способ прогноза рецидивирующего течения рожи. G 01 N 33/53 //Бюл. изобр. - 1989 - N6). Однако данный способ, как это следует из описания изобретения, дает наиболее точные результаты только у больных с наличием в генотипе HLAB35. В связи с этим общие показатели чувствительности, специфичности и точности указанного способа оказываются достаточно низкими. Кроме того, с его помощью не удается получить раздельный прогноз в отношении ранних и поздних рецидивов рожи.

Разработан также ряд способов прогноза рожистого воспаления, основанных на оценке показателей специфической (иммунной) и неспецифической резистентности лиц, страдающих этим заболеванием (авт.св. N 1068125 СССР /Рычнев В.Е. с соавт. Способ прогнозирования рожистого воспаления N A 61 К 39/00 //Бюл. изобр. 1984 N3; Фролов В. М. с соавт. Диагностическое и прогностическое значение уровня ЦИК у больных рецидивирующей рожей. //Врач. дело. - 1990 N 7 - с. 116-118; Пустовой Ю.Г. Клинико-иммунологические особенности и лечение рожи у рабочих машиностроительной промышленности: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Киев, 1990. - 15 с.; Коробка Ю.Н. Клинико-патагенетическая характеристика сенсибилизации к бактериальным и тканевым антигенам и лечебный эффект вилозена при роже: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Руганск 1991 - 19 с. и др.).

Общим недостатком этих способов является невозможность их использования в раннем периоде заболевания, а лишь перед выпиской больных из стационара. Кроме того, для осуществления прогноза авторами рекомендуется использование целой серии показателей неспецифической и иммунной реактивности, исследование которых, даже не в полном объеме, вряд ли реально в условиях обычного инфекционного стационара. И, наконец, учитывая то обстоятельство, что интегративный показатель вероятности раннего прогноза рожи необходимо рассчитывать путем суммирования отдельных показателей риска, при отсутствии хотя бы одного из них, либо при его уровне, не "дотягивающем" до прогностически значимого рубежа, прогноз у значительной части пациентов будет носить неопределенный характер. Поэтому при сохранении более или менее высокой чувствительности они, по-видимому, отличаются низкой специфичностью, точностью и ожидаемой ценностью. К сожалению, точных данных на этот счет авторы изобретений не приводят. Указанное объясняет, почему данные способы не нашли сколько-нибудь широкого применения в лечебной практике.

Наиболее близким к заявляемому по своему техническому решению и полученным результатам является "Способ прогноза хронического рецидивирующего течения заболевания у реконвалесцентов первичной рожи" (патент РФ N 2101701 /Амбалов Ю.М. с соавт. G 01 N 33/48, 33/569 //Бюл. изобрет. - 1998 N 1). Он и взят в качестве прототипа.

Существенным недостатком указанного способа является в первую очередь то, что его осуществление сопряжено с рядом технических трудностей, а именно формирования у пациентов кожного окна, фиксация на 24 ч стерильного покровного стекла на предварительно скарефицированный участок кожи, обработка мазков-отпечатков абсолютным спиртом, а затем кроличьей гипериммунной сывороткой к L-формам β-гемолитического стрептококка группы A, постановкой стандартной реакции непрямой иммунофлюоресценции с регистрацией мазка гранулярного свечения. Несомненно для этого необходимы соответствующим образом подготовленный персонал и технически оснащенная иммунологическая лаборатория.

Кроме того, способ может быть использован с максимальной точностью только через 3 месяца после перенесенного рожистого воспаления, что исключает возможность прогноза рецидирования заболевания в раннем его периоде.

Цель изобретения - более ранний и более точный прогноз ранних рецидивов заболевания у больных рожей.

Поставленная цель достигается следующим образом.

У больных рожей до начала лечения забирают кровь и проводят определение в ее плазме гидроперекисей липидов - ГПЛ (В.А. Гаврилов, М.И. Мишкорудная //Лабор. дело. - 1983. - N 3 - с. 33-36) и супероксидисмутазы - СОД (Е.Е. Дубинина с соавт. //Лабор. дело. - 1893. - N 19 - c. 30-33), а в сыворотке - малонового диальдегида МДА (К. Saton //Clin. chim. Acta. - 1978 - К90, N 1. - Р 37 - 43; О.Б. Смирнова Перекисное определение липидов и аутонейросенсибилизация при стрессе у животный с различной резистивностью и экспериментальному аллергическому энцефаломиелиту: . .. канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1990. - 190 с.), общей пероксидазной активности - ОПА (В.В. Внуков Железосодержащие белки и протеолитическая активность сыворотки крови при гипероксии и защитное действие мочевины: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Харьков, - 1979. - 20 с.) и активности каталазы (М.А. Королюк с соавт. //Лабор. дело. - 1988. - N 1 - c. 16-18).

Для определения концентрации ГПЛ в плазме крови измеряют ультрафиолетовое поглощение липидных экстрактов крови. Принцип метода основан на интенсивном поглощении коньюгированых диеновых структур ГПЛ в области 232-234 нм. Результаты измерения выражают в относительных единицах величины оптической плотности на 1 мл крови ( Δ D₂₃₃ на 1 мл крови). К 0,2 мл плазмы добавляют 4,0 мл смеси гептан-изопропанол (1:1) и встряхивают 10-15 мин. Далее в пробирку добавляют 1 мл р-ра HCE с pH 2,0 и 2,0 мл гептана, интенсивно встряхивают и после отстаивания и расслоения смеси через 20-30 мин отбирают гептановый слой, в котором измеряют D₂₃₃. Расчет содержания ГПЛ проводят в относительных единицах по формуле:
ΔD₂₃₃ D₂₃₃ на 1 мл плазмы = (D₂₃₃•V_Э)/V_П = 20•D₂₃₃,
где D₂₃₃ - измеренное значение оптической плотности;
V_Э=4 мл - конечный объем гептанового экстракта;
V_П=0,2 мл - объем взятой плазмы крови.

Определение активности СОД проводят следующим образом. К 1,0 мл плазмы добавляют 0,6 мл этилового спирта и 0,3 мл хлороформа и 600 мг кристаллического KH₂PO₄. Вещества, мешающие определению активности СОД, осаждают при перемешивании р-ра стеклянной палочкой с последующим центрифугированием при 12000 д и температуре 4^oC. Каждая процедура выполняется в течение 15 мин. Надосадочная жидкость, в которой определяют активность фермента, должна быть прозрачной и бесцветной. Об активности СОД в надосадочной жидкости судят по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии НАД-Н и феназинметасульфата. В состав инкубационной смеси входят 1 мкМ ЭДТА, 1 мг желатина, 0407 мМ нитросинего тетразолия, 1,8 мкМ феназин-метасульфата, 0,1 мл 1 мМ НАД-Н. НАД-Н растворяют в 1М трис-ЭДТА pH 8,0. Супернатант добавляют в инкубационную смесь в количестве 0,3 мл, что вызывает торможение восстановления нитросинего тетрозолия от 30% до 70%.

Общий объем инкубационной смеси доводят до 3 мл фосфатным буфером (0,15 М), pH 7,8. В контрольных пробах содержались те же компоненты реакционной смеси за исключением препарата фермента. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл 1 мМ НАД-Н в опытные и контрольные пробы. Инкубацию осуществляют 10 минут в темноте при комнатной температуре 20-22^oC в аэробных условиях. Через 10 мин измеряют величину оптической плотности исследуемых проб на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 540 нм против смеси, содержащей все компоненты, кроме НАД-Н.

Для расчета активности СОД вначале определяют процент торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия в опытной пробе за 1 мин (Т%). Принято считать, что 50% ингибирования этой реакции соответствует одной условной единице активности СОД. По формуле А = Т%/(100%-Т%) рассчитывают величину активности фермента, внесенного в кюветку (в условных единицах). Активность выражают в условных единицах, рассчитанных на 1 мл исследуемой плазмы.

Определение в сыворотке крови содержания малонового диальдегида осуществляют следующим образом. К 0,5 мл сыворотки доливают 2,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугируют еще 10 мин и при 3500 оборотов в минуту. Осадок промывают 2,0 мл 5% р-ра H₂SO₄ и снова центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. К осадку добавляют 2,5 мл 5% р-ра H₂SO₄ и 3,0 мл 0,2% р-ра тиобарбитуровой кислоты, приготовленного на насыщенном (0,2М) p-pe Na₂SO₄, и ставят пробирку на 30 мин на водяную баню (100^oC), после чего охлаждают и приливают 4,0 мл бутанола, встряхивают и центрифугируют 3000 об/мин, в течение 15 мин. Бутаноловую фракцию опытной пробы смотрим на спектрофотометре СФ-26 при длине волны λ = 530 нМ против контрольной бутаноловой фракции.

Расчет содержания МДА проводят по формуле:
С = (V•E_ЭКСТ)/(I•d• ε ),
где C - содержание МДА в нмоль/мл сыворотки;
V - объем пробы (в мл);
Е_эксп - показатель экстинции на приборе;
I - длина кюветы;
d - удельная плотность вещества;
ε - молярный коэффициент.

Активность каталазы определяют спектрофотометрически. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. К 1,0 мл три-HCE-буфера, 0,05М, pH 7,8 и 2,0 мл 0,03% р-ра перекиси водорода добавляют 0,1 мл сыворотки крови. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Спустя 10 мин к полученной смеси добавляют 1,0 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность развившейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которую вместо H₂O₂ вносят 2,0 мл H₂O.

Активность сывороточной каталазы рассчитывают по формуле:
Е = (A_ХОЛ-A_ОП)•V•t•К (мкат/л),
где E - активность сывороточной каталазы (в мкат/л);
A_ХОЛ и A_ОП - экстинция холостой и опытной проб;
V - объем вносимой пробы 0,1 мл;
t - время инкубации 600 с;
К - коэффициент миллимолярной экстинции H₂O₂, равный 22,2•10³ мМ^-1•см^-1.

Определение общей пероксидазной активности осуществляют также спектрофотометром. Принцип метода: пероксидаза окисляет в присутствии H₂O₂ бензидин, причем появляется синее окрашивание, которое подвергается количественному колориметрическому определению.

К 2,5 мл комплексного реактива добавляют 0,01 мл сыворотки крови и спустя 10 мин спектрофотометрируют против комплексного реактива при длине волны λ = 602 нм.

Комплексный реактив готовят следующим образом: 16 г ацетата натрия растворяют в 100 мл 7% р-ра уксусной кислоты. Далее раствор насыщают трилоном Б (ЭДТА) 1 г на кончике скальпеля. Взбалтывают, затем фильтруют. Фильтрат насыщают бензидином хлоргидратом или сернокислотным бензидином в количестве 1,0 г. Затем в течение 10 мин взбалтывают в колбе и снова фильтруют. К фильтрату прибавляют 30% 0,1 мл H₂O₂ (последнюю прибавляют непосредственно перед добавлением комплексного реактива к сыворотке).

Общая пероксидазная активность выражается в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки.

После получения конкретных результатов рассчитывают в соответствии с рекомендациями П. П. Голикова с соавт. (1997) величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле:

где ГПЛ_Х, МДА_Х, ОПА_Х, СОД_Х, К_Х - значения исследованных показателей у больного;
ГПЛ_N, МДА_N, ОПА_N, СОД_N, K_N - значения тех же показателей у здоровых людей (нормальная величина OAK соответствует 1,0 у.е.).

При выявлении у больного рожей в первые трое суток от начала заболевания величины OAK менее 1,6 у. е. прогнозируют развитие в ближайшие 6 месяцев ранних рецидивов рожистого воспаления.

Предоставленные данные основываются на результатах проведенных нами исследований у 101 больного рожей, из числа которых у 22, спустя 6 месяцев после перенесенного заболевания развились ранние рецидивы рожистого воспаления.

Получив в начальном периоде болезни соответствующие биохимические показатели и рассчитав величину OAK, были выделены три группы пациентов (табл. 1). В первой (22 человека) - исходная величина OAK находилась в пределах от 1,1 у.е. до 1,59 у.е., во второй (28 человек) - от 1,6 у.е. до 2,1 у.е. и в третьей (51 человек) - превышала 2,1 у.е.

Как показали последующие диспансерные наблюдения, частота рожистого воспаления в каждой из групп совершенно различна, составив в первой 95,5±4,5%, а во второй - всего 3,6±3,6%. У больных же третьей группы рецидивы заболевания в течение 6 месяцев наблюдения вообще зарегистрированы не были.

Как видно на табл. 1, из 22 пациентов, у которых у 21 исходные показатели OAK не превысили 1,6 у.е., в последующем развились рецидивы рожи. Это означает, что при выявлении в начальном периоде заболевания у больных величины OAK менее 1,6 у.е. с вероятностью 95,5% прогнозируется развитие ранних рецидивов рожистого воспаления.

С целью сравнения прогностической значимости предлагаемого и известного способов прогноза дополнительно была обследована группа больных рожей численностью 64 человека. У 28 из них при последующем наблюдении в течение 6 месяцев были зарегистрированы рецидивы заболевания (табл. 2), причем у 27 исходная величина OAK не превысила 1,6 у.е. В соответствии с заявленным способом во всех указанных случаях прогноз оказался верным.

У двух обследованных пациентов, исходя из полученных результатов, предполагалось развитие ранних рецидивов, однако таковые за указанные выше сроки наблюдения отмечены не были.

Как известно, по способу-прототипу прогнозирование может осуществляться лишь спустя 3 месяца после перенесенного рожистого воспаления. К сожалению, в течение этого периода у трех больных уже развились ранние рецидивы, поэтому общее количество пациентов, у которых можно было бы проводить прогноз по известному способу, составило не 64 а 61 человек. Из них рецидивы заболевания прогнозировались у 22, фактически же таковые были зарегистрированы у 25, т.е. ошибочно - недостаточное заключение было сделано в отношении 3 пациентов (табл. 3).

По итогам проведенных исследований были рассчитаны показатели чувствительности, специфичности и ожидаемой ценности сравниваемых способов прогноза (Н. У. Тиец. Лаборатория и ее роль в оказании первичной медицинской помощи //Лабор. дело. 1978 - N8 - С. 464-469; Й.М. Гранше, A. Ласцло. Серодиагностические тесты на туберкулез: потребность в оценке их практической прогностической точности и приемлемости //Бюл. ВОЗ. - 1990 - Т. 68, N 5 - c. 16-21).

1.Чувствительность = ИП/(ИП+ЛО)•100%,
где ИП (истинные положительные результаты) - число больных первой группы, у которых прогноз оказался правильным);
ЛО (ложные отрицательные результаты) - число больных первой группы, у которых прогноз оказался ошибочным).

2. Специфичность = ИО/(ИО+ЛП)•100%,
где ИО (истинные отрицательные результаты) - число больных второй группы, у которых прогноз оказался правильным);
ЛП (ложные положительные результаты) - число больных второй группы, у которых прогноз оказался ошибочным).

3. Точность = (ИП+ИО)/(ИП+ИО+ЛО+ЛП)•100% (эффективность).

4. Ожидаемая ценность = ИО/(ИО+ЛП)•100%.

Расчеты по заявляемому способу
1. Чувствительность = 28/(28+2)•100% = 93,3%
2. Специфичность = 34/(34+2)•100% = 94,4%
3. Точность = (28+34)/(28+34+2+2)•100% = 93,9%
4. Ожидаемая ценность = 28/(28+2)•100% = 93,3%
Расчеты по способу - прототипу
1. Чувствительность = 22/(22+3)•100% = 88,0%
2. Специфичность = 36/(36+3)•100% = 92,3%
3. Точность = (22+36)/(22+36+3+3)•100% = 90,6%
4. Ожидаемая ценность = 22/(22+3)•100% = 88,0%
Таким образом, предлагаемый способ, превосходя способ-прототип по чувствительности, специфичности, точности и ожидаемой ценности позволяет осуществлять с высокой вероятностью прогнозирование ранних рецидивов рожистого воспаления уже в первые трое суток заболевания. Методики биохимического определения гидроперекисей липидов плазмы, малонового диальдегида сыворотки, общей пероксидазной активности сыворотки, активности сывороточной каталазы и плазменной супероксидисмутазы, положенные в основу заявляемого способа, достаточно просты и доступны любой биохимической лаборатории.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная В., 62 лет (и.б. N 1119-96), поступила в отделение на второй день болезни. Была диагностирована первичная эритематозная рожа правой голени и стопы.

Биохимическое исследование крови (третий день):
1. ГПЛ плазмы - 2,4 ед. (норма - 1,6±0,2 ед.).

2. МДА сыворотки - 5,2 нмоль/мл (норма - 4,5±0,3 нмоль/мл).

3. ОПАС - 4,7 ед. (норма - 3,9±0,5 ед.).

4. Каталаза сыворотки - 98,8 мкат/л (норма - 68,9±2,7 мкат/л).

5. СОД плазмы - 1,74 ед. (норма - 1,75±0,03 ед.)

Исходная величина OAK оказалась равной 1,46 у.е., что позволило с вероятностью 95,5% прогнозировать у больной развитие раннего рецидива рожи. И действительно, спустя 5,5 месяцев у пациентки был зарегистрирован рецидив заболевания.

Пример 2. Больная С., 49 лет (и.б. N 699-96), поступила в отделение на второй день болезни. Диагностирована первичная эритематозно-геморрагическая рожа левой голени.

Исходный показатель OAK составил 2,4 у.е., что позволило отвергнуть развитие у данной больной рецидива заболевания. В течение последующих 6 месяцев наблюдения таковой зарегистрирован не был, что подтвердило высказанный благоприятный прогноз.

Способ может быть использован в медицине, а именно в лабораторной диагностике. Целью изобретения является более ранний и более точный прогноз ранних рецидивов заболевания у больных рожей. Определяют у больных рожистым воспалением с первых дней заболевания в плазме крови содержание гидроперекисей липидов (ГПЛ) и супероксидисмутазы (СОД), а в сыворотке - общую пероксидазную активность (ОПА), концентрацию малонового диальдегида (МДА) и активность каталазы (K). Рассчитывают величины оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле: OAK (у.е.) = (ГПЛ_X/ГПЛ_N•МДА_N)/МДА_N• ОПА_X/ОПА_N)/(СОД_X/СОД_N•К_X/К_N), где ГПЛ_X, МДА_X, ОПА_X, СОД_X, K_X - значения исследованных биохимических показателей у больных рожей; ГПЛ_N, МДА_N, ОПА_N, СОД_N, K_N - значения тех же показателей у здоровых людей. При величине OAK менее 1,6 (у. е.) прогнозируют развитие в ближайшие 6 месяцев рецидива рожистого воспаления. Способ обеспечивает сокращение времени и повышение точности прогнозирования. 4 табл.

Способ прогноза ранних рецидивов рожи путем биохимического исследования крови, отличающийся тем, что у больного рожей забирают венозную кровь и определяют в ее плазме содержание гидроперекисей липидов (ГПЛ) и супероксидисмутазы (СОД), а в сыворотке - общую перексидазную активность (ОПА), концентрацию малонового диальдегида (МДА) и активность каталазы (К), после чего по формуле рассчитывают величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента (ОАК):

где ГПЛ_x, МДА_x, ОПА_x, СОД_x, К_x - значения исследованных показателей у больного;
ГПЛ_N, МДА_N, ОПА_N, СОД_N, К_N - значения тех же показателей у здоровых людей (нормальная величина ОАК соответствует 1 у.е.),
путем деления произведения отношений значений ГПЛ, ОПА и МДА крови у больных рожей соответственно к таковым у здоровых лиц на произведение таких же отношений показателей СОД и каталазы и при величине ОАК < 1,6 у.е. прогнозируют (с вероятностью 95,5%) развитие у пациента в ближайшие 6 месяцев раннего рецидива заболевания.