СПОСОБ ПРОГНОЗА РАЗВИТИЯ БУЛЛЕЗНОЙ И ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ФОРМ РОЖИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, и может найти применение в практическом здравоохранении для прогноза развития неблагоприятно протекающих буллезной и геморрагической форм рожистого воспаления.

Рожа по-прежнему относится к числу наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека (В.Л. Черкасов. Рожа. - Медицина, 1986). Особенно тяжело протекают ее буллезная и геморрагическая формы. В этих случаях сроки выздоровления затягиваются. Именно эти формы болезни чаще всего приводят к инвалидизации больных вследствие развития деструктивных процессов в периферических лимфатических сосудах и лимфостаза. К сожалению наметившаяся в последние годы тенденция к увеличению частоты встречаемости буллезной и геморрагической рожи продолжает сохраняться (В.Л. Черкасов. Современное состояние рожи как стрептококковой инфекции: Тез. докл. 1-й Всес. науч.-практ. конф. - М. Луганск. 1989 - С.110-112). Между тем лечение указанных форм рожи представляет собой весьма трудную задачу (В.Л. Черкасов с соавт. Лечение больных с геморрагической формой рожи гепарином и тренталом //Врач. дело. - 1991. - N 10. - С.105-108).

В связи с этим представляется весьма актуальной проблема прогнозирования развития буллезной и геморрагической форм заболевания с целью своевременного проведения лечебных мероприятий по их предупреждению.

В патентной литературе мы нашли лишь один способ, касающийся прогноза рожистого воспаления (Левина Л. Д. с соавт. Патент РФ N 1778908, G 01 N 33/68. - "Способ прогнозирования развития геморрагической формы рожи"). Он и был взят нами в качестве прототипа.

Авторы этого способа использовали для решения поставленной задачи определение активности в плазме крови калликреина, что позволило при значениях указанного показателя менее 30 МЕД/мл прогнозировать у больных развитие геморрагической формы рожи.

Недостатками способа-прототипа следует признать сравнительно низкие его чувствительность (85%), специфичность (87%) и информативность (точность) (87%). Кроме того, этот способ оказался неприемлемым для прогнозирования развития буллезных форм болезни, также характеризующихся тяжелым течением.

Целью изобретения является повышение чувствительности, специфичности и точности прогноза развития геморрагической и буллезной форм рожи в раннем периоде заболевания.

Эта цель может быть достигнута путем определения у больных рожистым воспалением таких показателей оксидантно-антиоксидантной системы (АОС) крови как гидроперекиси липидов (ГПЛ) плазмы, малоновый диальдегид (МДА) сыворотки, общая пероксидазная активность сыворотки (ОПАС), сывороточная каталаза (К) и супероксидисмутаз (СОД) плазмы.

У больных с эритематозными проявлениями рожистого воспаления сразу после поступления в стационар забирают 3-4 мл крови в каждую из двух пробирок. В одну из них добавляют гепарин из расчета 20-25 ед. на 1 мл крови и центрифугируют в течение 10-15 минут. Далее забирают плазму и проводят определение содержания в ней гидроперекисей липидов - ГПЛ (В.А. Гаврилов, М.И. Мишкорудная //Лабор. дело. - 1983. - N 3 - С. 33-36) и супероксидисмутазы - СОД (Е. Е. Дубинина с соавт. //Лабор. дело. - 1893. - N 19 - С. 30-33), а в сыворотке - малонового диальдегида МДА (К. Saton //Clin. chim. Acta. - 1978 - К90, N 1. - P 37- 43; О.Б. Смирнова. Перекисное окисление липидов и аутонейросенсибилизация при стрессе у животных с различной резистивностью к экспериментальному аллергическому энцефаломиелиту: Дисс. канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1990. - 190 с.), общей пероксидазной активности - ОПА (В.В. Внуков. Железосодержащие белки и протеолитическая активность сыворотки крови при гипероксии и защитное действие мочевины: Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Харьков, - 1979. - 20 с.) и активности каталазы (М.А. Королюк с соавт. //Лабор. дело. - 1988. - N 1 - С.16-18).

Для определения концентрации ГПЛ в плазме крови измеряют ультрафиолетовое поглощение липидных экстрактов крови. Принцип метода основан на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых структур ГПЛ в области 232-234 нм. Результаты измерения выражают в относительных единицах величины оптической плотности на 1 мл крови (ΔD₂₃₃ на 1 мл крови). К 0,2 мл плазмы добавляют 4,0 мл смеси гептан-изопропанол (1:1) и встряхивают 10-15 минут. Далее в пробирку добавляют 1 мл р-ра HCE с pH 2,0 и 2,0 мл гептана, интенсивно встряхивают и после отстаивания и расслоения смеси через 20-30 минут отбирают гептановый слой, в котором измеряют D₂₃₃. Расчет содержания ГПЛ проводят в относительных единицах по формуле
ΔD₂₃₃ на 1 мл плазмы = (D₂₃₃•V_э)/V_п= 20•D₂₃₃,
где D₂₃₃ - измеренное значение оптической плотности;
V_э = 4 мл - конечный объем гептанового экстракта;
V_п = 0,2 мл - объем взятой плазмы крови.

Определение активности СОД проводят следующим образом. К 1,0 мл плазмы добавляют 0,6 мл этилового спирта и 0,3 мл хлороформа и 600 мг кристаллического KH₂PO₄. Вещества, мешающие определению активности СОД, осаждают при перемешивании р-ра стеклянной палочкой с последующим центрифугированием при 12000 д и температуре 4^oC. Каждая процедура выполняется в течение 15 минут. Надосадочная жидкость, в которой определяют активность фермента, должна быть прозрачной и бесцветной. Об активности СОД в надосадочной жидкости судят по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии НАД-Н и феназинметасульфата. В состав инкубационной смеси входят 1 мкМ ЭДТА, 1 мг желатина, 0407 мМ нитросинего тетразолия, 1,8 мкМ феназин-метасульфата, 0,1 мл 1 мМ НАД-Н. НАД-Н растворяют в 1М трис-ЭДТА pH 8,0. Супернатант добавляют в инкубационную смесь в количестве 0,3 мл, что вызывает торможение восстановления нитросинего тетрозолия от 30 до 70%.

Общий объем инкубационной смеси доводят до 3 мл фосфатным буфером (0,15 М), pH 7,8. В контрольных пробах содержались те же компоненты реакционной смеси за исключением препарата фермента. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл 1 мМ НАД-Н в опытные и контрольные пробы. Инкубацию осуществляют 10 минут в темноте при комнатной температуре (20-22^oC) в аэробных условиях. Через 10 минут измеряют величину оптической плотности исследуемых проб на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 540 нм против смеси, содержащей все компоненты, кроме НАД-Н.

Для расчета активности СОД вначале определяют процент торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия в опытной пробе за 1 минуту (Т%). Принято считать, что 50% ингибирования этой реакции соответствует одной условной единицы активности СОД. По формуле
А=Т%/(100%-Т%)
рассчитывают величину активности фермента, внесенного в кюветку (в условных единицах). Активность выражают в условных единицах, рассчитанных на 1 мл исследуемой плазмы.

Определение в сыворотке крови содержания малонового диальдегида осуществляют следующим образом. К 0,5 мл сыворотки доливают 2,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугируют еще 10 минут при 3500 об/мин. Осадок промывают 2,0 мл 5% р-ра H₂SO₄ и снова центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. К осадку добавляют 2,5 мл 5% р-ра H₂SO₄ и 3,0 мл 0,2% р-ра тиобарбитуровой кислоты, приготовленного на насыщенном (0,2М) p-pe Na₂SO₄ и ставят пробирку на 30 минут на водяную баню (100^oC), после чего охлаждают и приливают 4,0 мл бутанола, встряхивают и центрифугируют 3000 об/мин в течение 15 минут. Бутаноловую фракцию опытной пробы смотрим на спектрофотометре СФ-26 при длине волны λ = 530 нМ против контрольной бутаноловой фракции.

Расчет содержания МДА проводят по формуле
C = (V•E_экст)/(l•d•ε),
где C - содержание МДА в нмоль/мл сыворотки;
V - объем пробы (в мл);
E_ЭКСП - показатель экстинции на приборе;
l - длина кюветы;
d - удельная плотность вещества;
ε - молярный коэффициент.

Активность каталазы определяют спектрофотометрически. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. К 1,0 мл три-HCE-буфера, 0,05М, pH 7,8 и 2,0 мл 0,03% р-ра перекиси водорода добавляют 0,1 мл сыворотки крови. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Спустя 10 минут к полученной смеси добавляют 1,0 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность развившейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которую вместо H₂O₂ вносят 2,0 мл H₂О. Активность сывороточной каталазы рассчитывают по формуле
E=(A_хол-A_оп)•V•t•K (мкат/л),
где E - активность сывороточной каталазы (в мкат/л);
A_хол и A_оп - экстинция холостой и опытной проб;
V - объем вносимой пробы 0,1 мл;
t - время инкубации 600 с;
K - коэффициент миллимолярной экстинции H₂O₂, равный 22,2•10³ мМ^-1•см^-1.

Определение общей пероксидазной активности осуществляют также спектрофотометром. Принцип метода: пероксидаза окисляет в присутствии H₂O₂ бензидин, причем появляется синее окрашивание, которое подвергается количественному колориметрическому определению.

К 2,5 мл комплексного реактива добавляют 0,01 мл сыворотки крови и спустя 10 минут спектрофотометрируют против комплексного реактива при длине волны λ = 602 нМ.

Комплексный реактив готовят следующим образом: 16 г ацетата натрия растворяют в 100 мл 7% р-ра уксусной кислоты. Далее раствор насыщают трилоном Б (ЭДТА) 1 г на кончике скальпеля. Взбалтывают, затем фильтруют. Фильтрат насыщают бензидином хлоргидратом или сернокислотным бензидином в количестве 1,0 г. Затем в течение 10 минут взбалтывают в колбе и снова фильтруют. К фильтрату прибавляют 30% 0,1 мл H₂O₂ (последнюю прибавляют непосредственно перед добавлением комплексного реактива к сыворотке).

Общая пероксидазная активность выражается в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки.

После получения конкретных результатов рассчитывают в соответствии с рекомендациями П. П. Голикова с соавт. (1997) величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле

где ГПЛ_X, МДА_X, ОПА_X, СОД_X, К_X - значения исследованных показателей у больного;
ГПЛ_N, МДА_N, ОПА_N, СОД_N, К_N - значения тех же показателей у здоровых людей (нормальная величина OAK соответствует 1,0 у.е.).

Другими словами, сначала величины каждых из пяти выявленных у конкретного пациента биохимических показателей делят на таковые, соответствующие норме. Затем полученные числа перемножают, причем отдельно по значениям факторов оксидантной (ГПЛ плазмы, МДА сыворотки и ОПАС) и антиоксидантной системы (СОД плазмы и каталаза сыворотки). И, наконец, произведение первых делят на произведение вторых, получая величину OAK, выражаемую в условных единицах (у. е. ). При выявлении у больного с эритематозными проявлениями рожистого воспаления в первые двое суток заболевания величины OAK более 2,0 у. е. прогнозируют развитие в ближайшие сутки буллезной или геморрагической рожи.

Предоставленные материалы базируются на результатах проведенных исследований у 101 больного рожей, у 50 из них развились эритематозная, а у 51 - буллезная или геморрагическая формы заболевания. В последнюю группу вошли как лица, у которых на момент поступления в стационар уже имелись клинические проявления буллезной или геморрагической рожи (30 больных), так и пациенты, у которых при поступлении рожистое воспаление носило эритематозный характер и лишь впоследствии трансформировалось в буллезную или геморрагическую форму заболевания (21 человек).

Как видно из табл. 1, доверительный интервал показателей ОКА у больных эритематозной формой заболевания при поступлении колебался от 1,2 до 2,0 у. е. У лиц же, у которых исходно эритематозная рожа трансформировалась в последующем в буллезную или геморрагическую, доверительный интервал OAK оказался совершенно иным, составив 2,1 у.е. - 2,9 у.е., что практически не отличалось от таковой в группе пациентов, поступивших в стационар с уже развившейся буллезной или геморрагической рожей.

С целью сравнения прогностической значимости предлагаемого и известного способа (прототипа) нами дополнительно была обследована группа больных рожей численностью 83 человека, поступивших в стационар с эритематозными проявлениями рожи. У 51 из них характер местного воспаления остался прежним (вторая группа), у 32 - эритематозное воспаление трансформировалось в буллезное или геморрагическое (первая группа).

У всех больных при поступлении в стационар определялись пять вышеуказанных биохимических показателей крови, после чего рассчитывалась величина OAK. Кроме того, параллельно определялась (в соответствии с прототипом) активность калликреина плазмы (по методу Т.С. Пасхиной и А.В. Кринской, 1974).

Если по заявленному способу прогноз развития буллезной или геморрагической рожи оказался безошибочным у 31 из 32 пациентов (96,9±3,1%), то по способу-прототипу лишь у 24 из 32 (75,0±7,6%, P<0,01).

Сравнительный анализ результатов прогноза по заявляемому способу и прототипу приведен в табл. 2 и 3.

По итогам проведенных исследований были рассчитаны показатели чувствительности, специфичности и ожидаемой ценности сравниваемых способов прогноза (Н. У. Тиец. Лаборатория и ее роль в оказании первичной медицинской помощи /Лабор. дело. 1978 - N8 - С.464-469; Й.М. Гранше, А. Ласцло. Серодиагностические тесты на туберкулез: потребность в оценке их практической прогностической точности и приемлемости //Бюлл. ВОЗ.- 1990 - Т.68, N5 - С. 16-21).

1. Чувствительность = ИП/(ИП+ЛО) • 100%,
где ИП (истинные положительные результаты) - число больных первой группы, у которых прогноз оказался правильным);
ЛО (ложные отрицательные результаты) - число больных первой группы, у которых прогноз оказался ошибочным;
2. Специфичность = ИО/(ИО+ЛП) • 100%,
где ИО (истинные отрицательные результаты) - число больных второй группы, у которых прогноз оказался правильным;
ЛП (ложные положительные результаты) - число больных второй группы, у которых прогноз оказался ошибочным;
3. Точность = (ИП+ИО)/(ИП+ИО+ЛО+ЛП) • 100%;
(эффективность)
4. Ожидаемая ценность = ИО/(ИО+ЛП) • 100%,
Расчеты по заявляемому способу
1. Чувствительность = 31/(31+1) • 100% = 96,9%;
2. Специфичность = 51/(51+1) • 100% = 98,0%;
3. Точность = (31+51)/(31+51+1+1) • 100% = 97,6%;
4. Ожидаемая ценность = 31/(31+1) • 100% = 96,9%.

Расчеты по способу-прототипу
1. Чувствительность = 24/(24+8) • 100% = 75,0%;
2. Специфичность = 51/(51+8) • 100% = 86,4%;
3. Точность = (24+51)/(24+51+8+8) • 100% = 82,4%:
4. Ожидаемая ценность = 24/(24+8) • 100% = 75,0%.

Таким образом, предлагаемый способ, превосходя способ-прототип по чувствительности, специфичности, точности и ожидаемой ценности, позволяет осуществлять с высокой вероятностью прогнозирование в самом раннем периоде заболевания развитие буллезной и геморрагической форм рожи.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Больная В., 62 года (и.б. N1209-95), поступила в первые сутки заболевания. Диагностирована первичная рожа левой голени и бедра, эритематозная форма.

Биохимическое исследование крови (второй день болезни):
1. ГПЛ плазмы - 3,5 ед. (норма -1,6±0,2ед.);
2. МДА сыворотки - 6,9 нмоль/мл (норма - 4,5±0,3 нмоль/мл);
3. ОПАС-6,0 ед. (норма - 3,9±0,5 ед.);
4. Каталаза сыворотки - 129,0 мкат/л (норма - 68,9±2,7 мкат/л);
5. СОД плазмы - 1,77 ед. (норма - 1,75±0,03 ед.).

На основании полученных результатов была рассчитана величина OAK

Величина OAK, равная 2,7 у.е., позволяет предположить у данной больной буллезную либо геморрагическую формы рожи. И действительно, спустя 12 часов было зарегистрировано появление в области эритемы нескольких пузырьковых элементов, заполненных кровянистой жидкостью. Это позволило констатировать развитие геморрагической формы рожистого воспаления.

Пример 2. Больная Н., 64 года (и.б. N754-96), поступила в стационар на второй день болезни. С учетом анамнестических и клинических данных квалифицирована рецидивирующая эритематозная рожа правой голени.

При расчете исходная величина OAK оказалась равной 1,6 у.е., что практически исключило возможность развития у данной больной буллезной либо геморрагической формы заболевания. Дальнейшее наблюдение за больной полностью подтвердило наш прогноз. Эритематозное воспаление кожи не трансформировалось в буллезное или геморрагическое.

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, и предназначено для прогноза развития буллезной или геморрагической формы рожистого воспаления. Способ обеспечивает повышение чувствительности, специфичности и точности прогноза развития геморрагической и буллезной форм рожи в раннем периоде заболевания. Определяют у больных рожей в начальном периоде заболевания ряд показателей оксидантно-антиоксидантной системы крови: гидроперекиси липидов (ГПЛ) плазмы, малоновой диальдегид (МДА) сыворотки, общую пероксидазную активность сыворотки (ОПАС), сывороточную каталазу (К) и плазменную супероксидисмутазу (СОД) с последующим расчетом величины оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле

где ГПЛ_Б , МДА_Б , ОПА_Б , СОД_Б, К_Б - значения исследованных биохимических показателей у больных рожей; ГПЛ_ЗД, МДА_ЗД, ОПА_ЗД, СОД_ЗД, К_ЗД - значения тех же показателей у здоровых людей. При величине OAK более 2,0 у. е. прогнозируют развитие в ближайшие сутки буллезной или гемморагической рожи. 4 табл.

Способ прогноза буллезной и геморрагической формы рожи, включающий биохимическое исследование крови, отличающийся тем, что у больных с эритематозной рожей в первые двое суток заболевания определяют уровень гидроперекисей липидов плазмы и малонового диальдегида сыворотки, общую пероксидазную активность сыворотки, активность сывороточной каталазы и плазменной супероксидисмутазы, после чего рассчитывают величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента по формуле

где ГПЛ_Б, МДА_Б, ОПА_Б, СОД_Б, К_Б - значения исследованных биохимических показателей у больных рожей;
ГПЛ_ЗД, МДА_ЗД, ОПА_ЗД, СОД_ЗД, К_ЗД - значения тех же показателей у здоровых людей,
при величине ОАК более 2,0 у.е. прогнозируют развитие буллезной или геморрагической форм рожи.