СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ НАЗНАЧЕНИЯ ЭМОКСИПИНА БОЛЬНЫМ РОЖЕЙ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/68 G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням, и может быть использовано при лечении больных рожей.

Рожа, вызываемая, как известно, β-гемолитическим стрептококком группы А, является одной из наиболее распространенных инфекционных болезней человека (Н.Д.Ющук, Ю.Я.Венгеров, 1999). Заболевание проявляется клинически симптомами поражения кожи и лихорадочно-интоксикационным синдромом, а патогенетически - нарушениями иммунной, свертывающе-антисвертывающей, калликреин-кининовой, оксидантно-антиоксидантной и других систем организма (Черкасов В.Л. Рожа. - Л.; Медицина, 1986; Амбалов Ю.М. Патогенетические и прогностические аспекты рожи: Дисс.... докт. мед. наук. - М., 1996; Ю.М.Амбалов с соавт. Роль оксидантно-антиоксидантной системы крови в патогенезе рожистого воспаления // Возрастные аспекты патологии внутренних органов: Тез. обл. юбил. науч.-практ. конф. - Ростов-на-Дону, 1998. - С.56-57).

Если диагностика рожи не вызывает особых затруднений, поскольку базируется в подавляющем большинстве случаев на выявлении достаточно характерных клинических симптомов, то применяющееся в настоящее время лечение разработано совершенно недостаточно.

Так, использование у больных рожей антибиотиков приводит к быстрой нормализации температуры тела и исчезновению симптомов интоксикации, но практически не влияет на выраженность и характер местного воспалительного процесса кожи. Между тем развитие буллезных и геморрагических форм рожистого воспаления может способствовать формированию лимфостаза и слоновости, обезображивающих и инвалидизирующих больного (Фролов В.М., Рычнев В.Е. Патогенез и диагностика рожистой инфекции. - Воронеж, 1986). Абсолютное большинство применяемых в практической медицине лекарственных средств и методов патогенетического лечения (Сокол А.С. с соавт. Эффективность комплексного лечения больных рожей с применением сока каланхоэ // Врач. дело. - 1973. - №3. - С.137-139; Ковалева Н.М. Комплексное лечение больных рожей с применением димексида//Клин. хирургия. - 1981. - №1. - С.20-22; Черкасов В.Л. Рожа. - Л.: Медицина, 1986; Гебешш В.В. с соавт. Эффективность олазоля в комплексном лечении больных рожей // Акт. пробл. рожистой инфекции: Тез. докл. 1-й Всесоюз. науч.-практ. конф. - М.; Ворошиловград, 1989. - С.28-29; Патент РФ №2120286 “Способ лечения рожи” (Амбалов Ю.М. с соавт., 1995); Патент РФ №2096039 “Средство для лечения рожистого воспаления нижних конечностей” (Амбалов Ю.М. с соавт., 1995) также не способны сколько-нибудь позитивно влиять на развитие кожных поражений. Единственным способом лечения рожи, при котором удается достичь быстрой инволюции и уменьшения выраженности местного воспаления кожи, является тот, при котором используется препарат антиоксидантной направленности - эмоксипин, назначаемый больным в дозе 10 мл внутримышечно ежедневно в течение 10 дней в дополнение к стандартной этиопатогенетической терапии (Амбалов Ю.М. с соавт. “Клинико-биохимическая оценка эффективности эмоксипина у больных рожей // Сб. матер. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию медслужбы и 50-летию медсанчасти ОАО “Ростсельмаш”. - Ростов-на-Дону, 1997. - С.204-205; Амбалов Ю.М. с соавт. “Использование линкоцина, гемолизата аутокрови и эмоксипина в реабилитационной терапии больных рожей нижних конечностей” // Int. J. Immunoreabilitation. - 1997. - №4. - Р.126. - Р.36).

Патогенетическим основанием для разработки указанного способа лечения явились данные, свидетельствующие об активации при роже перекисно-окислительной составляющей оксидантно-антиоксидантной системы крови при параллельном снижении уровня антиоксидантных факторов. При этом выраженность сдвигов компонентов этой системы коррелировала с выраженностью и характером местного воспалительного процесса кожи (Амбалов Ю.М. с соавт. Патогенетическое значение перекисного окисления липидов при рожистой инфекции // Всесоюз. конф. “Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний”: Тез. докл. - Звенигород, 1990. - С.9; Кузнецов В.П., Пшеничная Н.Ю. Состояние оксидантно-антиоксидантной системы крови у больных рожистым воспалением // 51-я итоговая научн. конф.: Аннотация докл. Дня науки студентов, молодых ученых и специалистов РГМУ. - Ростов-на-Дону, 1997. - С.49). С учетом изложенного представлялось логичным использовать в качестве патогенетического лечебного средства один из существующих в настоящее время антиоксидантных препаратов - эмоксипин.

Однако последующий опыт применения эмоксипина у больных рожей показал, что при введении этого препарата не у всех больных удается добиться желаемого клинического эффекта. Более того, в ряде случаев вероятность рецидивов заболевания даже увеличивается.

В связи с этим в ходе обследования пациента с рожей возникает необходимость в каждом конкретном случае решать вопрос о целесообразности и возможной эффективности патогенетической терапии с применением эмоксипина. Подобного способа в научной и патентной литературе нам обнаружить не удалось.

Наиболее близким по технической сущности, который мы выбрали в качестве прототипа, является способ определения показаний к применению эмоксипина при лечении токсической дифтерии (патент РФ №2137128 (Амбалов Ю.М., Пополитова С.Б., 1999.). К сожалению, данный способ при всех своих достоинствах не может быть применен у больных рожей, поскольку разработан применительно совершенно к другому заболеванию - дифтерии.

Цель настоящего изобретения - определение целесообразности назначения эмоксипина больным рожей.

Способ осуществляется путем предварительного биохимического исследования в крови больных рожей пяти компонентов оксидантно-антиоксидантной системы, а именно гидроперекисей липидов (ГПЛ), супероксиддисмутазы (СОД), малонового диальдегида (МДА), каталазы и общей пероксидазной активности (ОПА). Кровь забирают до начала лечения и проводят определение в ее плазме - ГПЛ (Гаврилов В.А., Мишкорудная М.И.//Лабор. дело. - 1983. - №3. - С.33-36) и - СОД (Дубинина Е.Е.с соавт. // Лабор. дело. - 1983. - №19. - С.30-33), а в сыворотке - МДА (К. Saton // Clin. chim. Acta. - 1978 - K90, №1. - Р.37-43; Смирнова О.Б.// Перекисное определение липидов и аутонейросенсибилизация при стрессе у животных с различной резистентостью и эксприментальному аллергическому энцефаломиелиту:... канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1990. - 190 с.), ОПА (Внуков В.В. Железосодержащие белки и протеолитическая активность сыворотки крови при гипероксии и защитное действие мочевины: Автореф. дисс.... канд. биол. наук. - Харьков, 1979. - 20 с.) и активности каталазы (Королюк М.А. с соавт. // Лабор. дело. - 1988. - №1. - С.16-18).

Определение концентрации ГПЛ в плазме крови осуществляют путем измерения ультрафиолетового поглощения липидных экстрактов крови. Принцип метода основан на интенсивном поглощении коньюгированных диеновых структур ГПЛ в области 232-234 нм. Результаты измерения выражают в относительных единицах величины оптической плотности на 1 мл крови (AD₂₃₃ на 1 мл крови). К 0,2 мл плазмы добавляют 4,0 мл смеси гептанизопропанол (1:1) и встряхивают 10-15 мин. Далее в пробирку добавляют 1 мл р-ра НСЕ с рН 2,0 и 2,0 мл гептана, интенсивно встряхивают и после отстаивания и расслоения смеси через 20-30 мин отбирают гептановый слой, в котором измеряют D₂₃₃. Расчет содержания ГПЛ проводят в относительных единицах по формуле

ΔD₂₃₃ на 1 мл плазмы = (D₂₃₃*V_э)/V_п=20*D₂₃₃,

где D₂₃₃ - измеренное значение оптической плотности;

V_э=4 мл - конечный объем гептанового экстракта;

V_П=0,2 мл - объем взятой плазмы крови;

* - знак умножения.

Определение активности СОД проводят следующим образом. К 1,0 мл плазмы добавляют 0,6 мл этилового спирта и 0,3 мл хлороформа и 600 мг кристаллического КН₂РО₄. Вещества, мешающие определению активности СОД, осаждают при перемешивании р-ра стеклянной палочкой с последующим центрифугированием при 12000 g и температуре 4°С. Каждая процедура выполняется в течение 15 мин. Надосадочная жидкость, в которой определяется активность фермента, должна быть прозрачной и бесцветной. Об активности СОД в надосадочной жидкости судят по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии НАД-Н и феназинметасульфата. В состав инкубационной смеси входят 1 мкМ феназинметасульфата, 0,1 мл 1 мМ НАД-Н, НАД-Н растворяли в 1 М трис-ЭДТА рН 8,0. Супернатант добавляют в инкубационную смесь в количестве 0,3 мл, что вызывает торможение восстановления нитросинего тетразолия от 30 до 70%.

Общий объем инкубационной смеси доводят до 3 мл фосфатным буфером (0,15 М), рН 7,8. В контрольных пробах содержатся те же компоненты реакционной смеси за исключением препарата фермента. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл 1 мм НАД-Н в опытные и контрольные пробы. Инкубацию осуществляют за 10 мин в темноте при комнатной температуре (20-22°С) в аэробных условиях. Через 10 мин измеряют величину оптической плотности исследуемых проб на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 540 нм против смеси, содержащей все компоненты, кроме НАД-Н.

Для расчета активности СОД вначале определяют процент торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия в опытной пробе за 1 мин (Т%). Принято считать, что 50% ингибирования этой реакции соответствует одной условной единицы активности СОД. По формуле

А=Т%/(100%-Т%)

рассчитывают величину активности фермента, внесенного в кюветку (в условных единицах). Активность выражают в условных единицах, рассчитанных на 1 мл исследуемой плазмы.

Определение в сыворотке крови содержания МДА осуществляют следующим образом. К 0,5 мл сыворотки доливают 2,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугируют еще 10 мин при 3500 об/мин. Осадок промывают 2,0 мл 5% р-ра H₂SО₄ и снова центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. К осадку добавляют 2,5 мл 5% р-ра H₂S0₄ и 3,0 мл 0,2% р-ра тиобарбитуровой кислоты, приготовленного на насыщенном (0,2 М) р-ре Н₂SO₄, и ставят пробирку на 30 мин на водяную баню (100°С), после чего охлаждают и приливают 4,0 мл бутанола, встряхивают и фракцию опытной пробы смотрят на спектрофотометре СФ-26 при длине волны λ=530 нМ против контрольной бутаноловой фракции. Расчет содержания МДА проводят по формуле

С=(V*Е_экст)/(I*d*ε),

где С - содержание МДА в нмоль/мл сыворотки;

V - объем пробы (мл);

E_экст - показатель экстинции на приборе;

I - длина кюветы;

d - удельная плотность вещества;

ε - молярный коэффициент.

Активность каталазы определяют спектрофотометрически. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. К 1,0 мл три-НСЕ-буфера, 0,05 М, рН 7,8 и 2,0 мл 0,03% р-ра перекиси водорода добавляют 0,1 мл сыворотки крови. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Спустя 10 мин к полученной смеси добавляют 1,0 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность развившейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которую вместо Н₂O₂ вносят 2,0 мл Н₂О.

Активность сывороточной каталазы рассчитывают по формуле

E=(A_xoл-A_оп)* V*t*K (мкат/л),

где Е - активность сывороточной каталазы (мкат/л);

А_хол и А_оп - экстинция холостой и опытной проб;

V - объем вносимой пробы 0,1 мл;

t - время инкубации 600 с;

К - коэффициент миллимолярной экстинции H₂O₂, равный 22,2*10³ мM^-1*см^-1.

* - знак умножения.

Определение общей пероксидазной активности осуществляют также с помощью спектрофотометра. Принцип метода: пероксидаза окисляет в присутствии Н₂О₂ бензидин, причем появляется синее окрашивание, которое подвергается количественному колориметрическому определению.

К 2,5 мл комплексного реактива добавляют 0,01 мл сыворотки крови и спустя 10 мин спектрофотометрируют против комплексного реактива при длине волны λ=602 нМ.

Комплексный реактив готовят следующим образом: 16 г ацетата натрия растворяют в 100 мл 7%-ного р-ра уксусной кислоты. Далее раствор насыщают трилоном Б (ЭДТА) в количестве 1 г. Взбалтывают, затем фильтруют. Фильтрат насыщают бензидином хлоргидратом или сернокислотным бензидином в количестве 1,0 г. Затем в течение 10 мин взбалтывают в колбе и снова фильтруют. К фильтрату прибавляют 30% 0,1 мл Н₂О₂ (последнюю прибавляют непосредственно перед добавлением комплексного реактива к сыворотке). Общую пероксидазную активность выражают в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки.

После получения конкретных результатов рассчитывают в соответствии с рекомендациями Голикова П.П. с соавт. (Оценка эффективности и патогенетической фармакотерапии неотложных состояний на основе интегрального показателя дисбаланса перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы.// Клин. лабор. диагностика. - 1997. - №6. - с.52) величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле

где ГПЛ_х, МДА_х, ОПА_х, СОД_х, К_х - значения исследованных показателей у больного;

ГПЛ_N, МДА_N, ОПА_N, СОД_N, K_N - значения тех же показателей у здоровых людей (нормальная величина OAK соответствует 1,0 у.е.);

* - знак умножения.

Выявление у больного рожей в первые три дня от начала заболевания до начала лечения величины OAK более 2,1 ед. позволяет прогнозировать благоприятный клинический эффект от проведения лечения с применением эмоксипина.

Клиническая апробация предлагаемого способа была проведена в 5-м инфекционном отделении ГБ №1 г. Ростова-на-Дону, являющемся базой кафедры инфекционных болезней Ростовского государственного медицинского университета. Под наблюдением находилось 182 больных рожей, из числа которых 91 получил традиционную этиопатогенетическую терапию, а 91 - дополнительно эмоксипин по 1,0 мл внутримышечно ежедневно в течение 10 дней.

Анализ результатов исследования показателей оксидантно-антиоксидантной системы крови у больных рожей показал (таблица), что, если исходная величина OAK, определяемая у больных рожей в первые три дня заболевания была меньше или равна 2,1 ед., то лечение с назначением эмоксипина не давало каких-либо клинических преимуществ по сравнению со стандартной терапией лиц контрольной группы (таблица). В тех же случаях, когда величина OAK превышала 2,1 ед., эффект от использования эмоксипина был выражен достаточно четко. Об этом свидетельствует более чем двукратное снижение числа лиц с длительно (более 3-х дней) сохраняющимся лихорадочно-интоксикационным синдромом, а также значительное снижение частоты перехода эритематозного воспаления кожи в более неблагоприятное - буллезное или геморрагическое. При этом увеличение частоты рецидивирования заболевания не наблюдалось.

Как нам представляется, показатель OAK, равный или превышающий 2,1 ед., свидетельствует о выраженной активации у больных рожей перекисно-окислительных процессов и одновременном угнетении антиоксидантных систем защиты. Именно в этом случае организм больных рожей становится особенно восприимчив к воздействию эмоксипина, поскольку испытывает максимальную потребность в антиоксидантах. Подтверждением эффективности предложенного способа являются клинические примеры.

Пример 1. Больная К., 57 лет (и.б. 881 - 01), поступила в 5-е инфекционное отделение городской больницы №1 им. Н.А.Семашко г. Ростова-на-Дону на 2-й день болезни с явлениями эритематозно-буллезной рожи. Исходный OAK оказался равным 2,4 у.е., что требовало назначение пациентке помимо антибиотиков эмоксипина. Уже спустя 7 ч после введения препарата состояние больной значительно улучшилось. Температура тела критически упала с 38,4 до 36,1°С, практически исчезли симптомы интоксикации. Еще через сутки стал быстро инволюционировать местный воспалительный процесс кожи. Трансформации рожистого воспаления в геморрагическую фору не произошло. В течение всего срока наблюдения (после выписки из стационара) рецидивов заболевания зарегистрировано не было. Это свидетельствует о правильном определении показаний к назначению данной больной эмоксипина.

Пример 2. Больная М., 49 лет (и.б. №1021 - 01), поступила в то же отделение на 3-й день болезни с диагнозом: “Первичная эритематозная рожа правого бедра и голени”. Заболевание проявлялось, помимо воспалительных изменений на коже, гипертермией до 40,1°С и выраженными симптомами интоксикации. Исходная величина OAK оказалась равной 1,6 ед., поэтому показаний для назначения эмоксипина не было. Тем не менее, лечащим врачом наряду с антибиотиком (линкомицином) был назначен и эмоксипин. Уже спустя сутки температура тела снизилась до нормальных цифр, общее состояние стало улучшаться. Эритематозные явления на коже пошли на убыль, однако сравнительно медленно. Даже спустя 10 дней с момента поступления в стационар сохранялись умеренные гиперемия и болезненность кожи пораженной конечности. По категорическому настоянию родственников больная была выписана из стационара. Но спустя 1,5 месяца вновь повысилась температура тела, и на той же конечности появились краснота, отечность и болезненность кожи, что позволило квалифицировать у пациентки рецидив рожистого воспаления. Это свидетельствовало об отсутствии полноценного эффекта от лечения с применением эмоксипина, что и прогнозировалось на начальных этапах заболевания, когда больная поступила в стационар.

Предлагаемый способ обеспечивает целесообразность назначения эмоксипина в комплексном лечении рожи с положительными результатами и предупреждает возникновение различных рецидивов.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и предназначено для определения целесообразности назначения эмоксипина при лечении рожи. У больных рожей в первые три дня болезни до начала лечения забирают венозную кровь для биохимического исследования показателей оксидантно-антиоксидантной системы и определяют в ее плазме содержание гидроперекисей липидов (ГПЛ) и супероксиддисмутазы (СОД), а в сыворотке - общую пероксидазную активность (ОПА), концентрацию малонового диальдегида (МДА) и активность каталазы (К), затем рассчитывают величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента (ОАК) по формуле

(где ГПЛ_х, МДА_х, ОПА_х, СОД_х, К_х - значения исследованных биохимических показателей у больных, а ГПЛ_N, МДА_N, СОД_N, К_N - у здоровых людей). При величине ОАК 2,1 ед. и выше прогнозируется благоприятный эффект от лечения с применением эмоксипина. Способ обеспечивает определение эффективности терапии эмоксипином больных рожей. 1 табл.

Способ определения целесообразности назначения эмоксипина больным рожей, предусматривающий исследование крови, отличающийся тем, что у больного в первые три дня болезни до начала лечения забирают венозную кровь для биохимического исследования показателей оксидантно-антиоксидантной системы и определяют в ее плазме содержание гидроперекисей липидов (ГПЛ) и супероксиддисмутазы (СОД), а в сыворотке - общую пероксидазную активность (ОПА), концентрацию малонового диальдегида (МДА) и активность каталазы (К), затем рассчитывают величину оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле

где ГПЛ_х, МДА_х, ОПА_х, СОД_х, К_х - значения исследованных биохимических показателей у больных;

а ГПЛ_N, МДА_N, ОПА_N, СОД_N, К_N - у здоровых людей,

и при величине OAK 2,1 ед. и выше считают целесообразным назначение эмоксипина наряду с традиционной терапией.