ЖИВАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ КОРЕВАЯ ВАКЦИНА Российский патент 2000 года по МПК A61K35/76 A61K39/165 

Изобретение относится к медицине и касается создания живой культуральной вакцины для иммунизации детей.

Известна живая культуральная коревая вакцина, содержащая сухую вирусную суспензию штамма Ленинград-16 (Л-16) с биологической активностью вируса 10^3.5ТЦД₅₀ и стабилизатор сорбит и желатозу (см. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М., "Медицина", 1978 г., стр. 220-223).

Технической задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента коревых вакцин, создание вакцины стабильной при хранении и обеспечивающей при вакцинации длительный иммунитет.

Для решения поставленной задачи получена вакцина коревая культуральная живая сухая (Vaccinum morbillorum culturarum vivum sicum), предназначенная для активной профилактики кори.

Вакцина представляет собой вирус кори штамм Ленинград-16 (Л-16) или (Л-16М) или Москва-5 (М-5), полученный в культуре клеток эмбрионов Японских перепелок или перепелов линии "Фараон".

Коревая вакцина содержит сухую вирусную суспензию указанных штаммов с биологической активностью не ниже 2.51gТЦД₅₀/0.5 мл; стабилизатор, представляющий собой смесь 50% раствора сорбита и 25% раствора желатозы или смесь стабилизатора ЛС-18 и 10% раствора желатина; антибиотик канамицина моносульфат или гентамицина сульфат до 20 ед. в дозе вакцины и аминопептид.

Препарат не содержит интактных клеток. Вакцина представляет собой однородную массу желто-розового или розового цвета. Готовая вакцина в сухом виде запаяна в ампулах или флаконах по одной, две или пять доз в объеме 0.1±0.012 мл или 0.2±0.02 мл и содержит не менее 1000 ТЦД.

Непосредственно перед употреблением вакцину растворяют в растворе 0.5±0.1 мл на одну прививочную дозу.

Растворенная вакцина представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую, розовую или бесцветную жидкость, не содержащую взвешенных частиц.

Пример 1.

Для производства культуральной, живой, сухой, коревой вакцины используют вакцинные штаммы вируса кори Л-16, М-5 и Л-16 М.

Вакцинный штамм вируса кори Л-16 выведен в 1960 г. в Ленинградском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера из крови больного корью ребенка на первичной культуре клеток почек новорожденных морских свинок (ПМС), в которой прошел 21 пассаж, после чего дополнительно аттенуирован в культуре клеток эмбрионов японских перепелок (2 пассажа).

Вакцинный штамм вируса кори М-5 получен в лаборатории коревых и паротитных вакцин Московского НИИ вирусных препаратов в 1978 году из штамма Л-16 путем троекратного клонирования клеток эмбрионов японских перепелов при температуре 35^oC.

Из вакцинного штамма готовят сухие производственные штаммы, которые хранят в лиофилизированном состоянии при температуре минус 50±10^oC, он имеет активность не ниже 31gТЦД₅₀/0.5 мл.

Из производственного штамма получают промежуточный пассаж со специфической активностью не ниже 10^5.0ТЦД₅₀/0.5 мл.

Промежуточный пассаж используют для приготовления серий посевного вируса, специфическая активность которого не ниже 10^5.0ТЦД₅₀/0.5 мл и который хранят в замороженном состоянии при температуре 55±5^oC в течение 18 месяцев.

Пассивирование производственных штаммов и получение из них посевных вирусов проводят с таким расчетом, чтобы число дополнительных пассажей не превышало 10.

Для приготовления промежуточного пассажа 2-3 суточный монослой культуры клеток эмбрионов перепелов заражают вакцинным штаммом вируса кори Л-16. Множественность заражения от 0.001 до 0.02 ТЦД₅₀ на клетку.

С клеточного монослоя с выраженной специфической дегенерацией собирают вирусные сборы, которые после добавления в них 10% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) контролируют на стерильность.

До окончания контролей индивидуальные вирусные сборы хранят при температуре 4±2^oC. Стерильные вирусные сборы с титром не ниже 3.51gТЦД₅₀/0.5 мл объединяют в одну емкость, разливают по флаконам и хранят при температуре (-55±5)^oC.

Полученный промежуточный пассаж, каждый в отдельности, контролируют на стерильность и специфическую активность.

Из 9-10 дневных эмбрионов перепелов готовят культуру клеток и двух-трех суточный монослой заражают промежуточным пассажем. Множественность заражения от 0.001 до 0.01 ТЦД₅₀ на клетку.

Клеточную взвесь с вирусом разливают по емкостям и инкубируют при температуре (35±1)^oC в роллерной установке со скоростью вращения 28±1 об/час. Через 3 суток роллерные бутыли с хорошо сформированным монослоем подвергают 6-и кратному отмыванию раствором Хенкса pH 7.4±2.

Из роллерных бутылей удаляют питательную среду, вносят от 120 до 150 мл солевого раствора, помещают в роллерную установку и вращают не менее 3 минут со скоростью вращения 10±1 об/мин. Операцию отмывания монослоя повторяют 6 раз.

После отмывания монослоя в роллерные бутыли вносят до 300 мл поддерживающей среды 199 с добавлением канамицина моносульфата или гентамицина сульфата до 100 ед./мл, 5% аминопептида и продолжают инкубировать в роллере при (35±1)^oC.

Начиная с 4-6-и суток от момента культивирования инфицированных клеток и с появлением и нарастанием специфической дегенерации каждые сутки удаляют всю среду и заменяют ее новой. Вируссодержащую жидкость сливают во флаконы различной емкости (индивидуальные вирусные сборы). В роллерные бутыли добавляют свежую среду по объему, равному объему слитой вируссодержащей жидкости. Сбор вируссодержащей жидкости и замену ее свежей поддерживающей средой проводят многократно до тех пор, пока на поверхности стенок сохраняется не менее 50% клеток.

Индивидуальные вирусные сборы хранят при (4±2)^oC.

Все стерильные индивидуальные вирусные сборы во флаконах со специфической активностью не ниже 4.51gТЦД₅₀/0.5 мл после осаждения клеток (от 5 до 14 суток) помещают в слой сухого льда для замораживания осадка.

Надосадочную жидкость из флаконов объединяют в бутыль. К объединенному вирусному сбору добавляют 25%-ную желатозу и 50% сорбит в соотношениях: на 700 мл вирусного сбора (17.5% сухой вирусной суспензии) добавляют 200 мл желатозы и 100 мл сорбита. Объем вирусной жидкости в 5,0 л бутыли должен быть 2,5 л с содержанием аминопептида 2.5 - 3.5%.

В бутыль с вирусной жидкостью сначала в условиях вакуума вносят желатозу, а затем сорбит. При использовании стабилизатора ЛС-18 и желатина 10%-ного к объединенному вирусному сбору добавляют ЛС-18 и желатин 10% в соотношениях: на 500 мл вирусного сбора (16.5% сухой вирусной суспензии) добавляют 400 мл ЛС-18 и 100 мл желатина 10%-ного.

Жидкий полуфабрикат хранят до 25 суток при (4±2)^oC и не более 1 года при температуре (40±2)^oC.

Жидкий полуфабрикат, хранящийся при (-55±5)^oC, за 24-48 часов до разлива оттаивают при температуре (4±2)^oC и тщательно перемешивают с жидким полуфабрикатом, хранящимся при (4±2)^oC.

Жидкий полуфабрикат вакцины разливают по (0,1±0,02) мл или (0,2±0,02) мл в стерильные ампулы или флаконы.

Полуфабрикат вакцины, содержащий сорбит и желатозу, разливают при температуре (4±2)^oC, а со стабилизатором ЛС-18 при комнатной температуре.

Ампулы с вакциной хранят при (6±2)^oC не более 5 часов.

Далее осуществляют замораживание разлитой в ампулы вакцины при температуре -30^oC и сублимационное высушивание.

При этом серии вакцины со стабилизатором сорбит-желатоза по окончании процесса замораживания камеру вакуумируют до остаточного давления не выше 10 Па (75 мкм рт. ст.). Высушивание производится без циркуляции теплоносителя. Длительность 2 часа.

Температура препарата на стадии сублимации не должна превышать -40^oC. Общая длительность процесса сушки 40-44 часа.

Сушка предварительно замороженной вакцины со стабилизатором ЛС-18 проводится при давлении не выше 10 Па (75 мкм рт. ст.) без циркуляции теплоносителя, при температуре препарата на стадии сублимации не выше -40^oC, длительность процесса сушки 46-54 часа.

За счет присутствия стабилизатора ЛС-18 вакцина приобретает термостабильность и имеет биологическую активность не ниже 2.5 ед. ТЦД₅₀/0.5 мл.

Готовую вакцину хранят при (6±2)^oC и относительной влажности не более 60%.

Срок годности 15 месяцев с момента лиофилизации.

Пример 2.

Испытание вакцины
Специфическая активность вакцин определялась следующим образом. Титр вируса определяли по цитопатическому действию вируса на чувствительность клетки (культуры клеток Vero). Все полевые испытания вакцины проводились в рамках плановой вакцинопрофилактики на базе детских поликлиник. В работах принимали участие 4 детских поликлиники Центрального округа г.Москвы, детские поликлиники Московской области (г. г. Ивантеевка, Одинцово, Жуковский, Реутов), а также детские поликлиники Могилевской, Гомельской, Николаевской и Мурманской областей. За время испытания 448 детей было вакцинировано отечественной живой вакциной из штамма Лениград-16 и 220 детей живыми коревыми вакцинами зарубежного производства.

Вакцинации подлежали дети в возрасте от 12 месяцев до 4 лет, не имеющие противопоказаний, не привитые против кори ранее и не болевшие корью. Требования к отбору детей для включения их в состав опытных и контрольной групп (возраст и состояние здоровья) были идентичны, т.е. по количеству, возрасту и анамнезу детей все группы были репрезентативны. Все группы детей были сформированы методом случайной выборки.

В каждой поликлинике все дети перед вакцинацией тщательно осматривались педиатрами. Заключение осмотра регистрировалось в индивидуальной карте ребенка. Ежедневное клиническое наблюдение за привитыми осуществлялось в течение 21 дня с момента вакцинации специально проинструктированным персоналом поликлиник (врачами-педиатрами и патронажными медицинскими сестрами). Кроме того, после специальной беседы родители получали дневник наблюдения за отклонения в состоянии здоровья ребенка. После окончания сроков наблюдения дневники дополнялись и исправлялись работниками поликлиник и, за личной подписью лечащего врача, централизованно переправлялись в ГИСК им. Тарасовича. Анализ реактогенности живых коревых вакцин проводился по учету сведений. Во время проведения всех клинических испытаний эпидобстановка среди наблюдаемых контингентов была благополучной.

Оценка реактогенных свойств
При учете реактогенности в дневниках наблюдения регистрировались как местные, так и общие реакции в течение 21 дня после вакцинации. Под местными реакциями подразумевается гиперемия, уплотнение, боль, жжение в месте введения. При регистрации общих реакций учитывались температура, сыпь, катаральные явления, расстройства желудочно-кишечного тракта и др. Температурные реакции условно разделялись на три группы: слабые (37.1 - 37.5), средние (37.6 -38.5) и сильные (38.6 и выше). Наивысшая температура за весь период наблюдения определяла, к какой группе интенсивности ее следует отнести.

Особое внимание, с учетом сроков развития вакцинального процесса, было уделено реакциям в период между 4-5 и 18 днями от момента прививки. Поэтому, по срокам возникновения общие реакции условно были разделены нами на "ранние" (с 1 по 4 сутки), "истинные" (с 5 по 18 сутки) и "запоздалые" (начиная с 19 дня после вакцинации).

В ходе исследований регистрировались все отклонения в состоянии здоровья детей в течение 21 дня после вакцинации, однако, при анализе связь реакций с вакцинацией оценивалась индивидуально.

В результате проведенных исследований выявлено, что живая коревая вакцина новой посевной серии характеризуется 100% сероконверсией привитых и, практически, ареактогенностью, вызывая легкие вакцинальные реакции лишь у 4.2% привитых.

Изобретение относится к медицине и касается создания живой культуральной вакцины для иммунизации детей. Сущность изобретения заключается в том, что живая культуральная коревая вакцина, содержащая сухую вирусную суспензию и стабилизирующие добавки, дополнительно содержит антибиотик (канамицина моносульфат или гентамицина сульфат) и аминопептид, а в качестве стабилизирующей добавки смесь 50% раствора сорбита и 25% раствора желатозы или смесь стабилизатора ЛС-18 и 10% раствора желатина, при этом содержит вирусную суспензию штамма (Л-16), или (Л16-М), или (М-5) с биологической активностью не ниже 2,5lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Технический результат заключается в создании вакцины, стабильной при хранении и обеспечивающей при вакцинации длительный иммунитет. 1 з.п.ф-лы.

1. Живая культуральная коревая вакцина, содержащая сухую вирусную суспензию и стабилизирующие добавки, отличающаяся тем, что вакцина дополнительно содержит антибиотик и аминопептид, а в качестве стабилизирующей добавки смесь 50% раствора сорбита и 25% раствора желатозы или смесь стабилизатора ЛС-18 и 10% раствора желатина, при этом содержит вирусную суспензию штамма Ленинград-16 (Л-16), или (Л16-М), или Москва-5 (М-5) с биологической активностью не ниже 2,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл при следующем соотношении компонентов, об.%:
Сухая вирусная суспензия штамма (Л-16), или (Л16-М), или (М-5) с биологической активностью не ниже 2,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл - 16,5 - 17,5
Антибиотик - До 20 ед. в дозе вакцины
Аминопептид - 2,5 - 3,5
Смесь 50% раствора сорбита и 25% раствора желатозы - 30
или
Смесь стабилизатора ЛС-18 и 10% раствора желатина - 50
2. Живая культуральная коревая вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве антибиотика она содержит канамицина моносульфат или гентамицина сульфат.