СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА КОРИ И ПОДДЕРЖИВАЮЩАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 A61K39/165 C12N5/08 

Изобретения относятся к медицинской биотехнологии и могут найти применение при получении вакцинных и диагностических препаратов вируса кори.

Известен способ получения культуральной коревой вакцины из отечественного штамма Ленинград-16, предусматривающий заражение вирусом первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбрионов перепелок (ФЭП) с последующим культивированием вируса в питательной среде 199 с добавлением 5% аминопептида (Васильева Г. А. , Бойчук Л.М. Отработка технологии производства живой коревой вакцины Л-16 на тканевой культуре из эмбрионов японских перепелок. - "Специф. профилактика кори". - Материалы научно-практич. конф. ЛНИИ им. Пастера, - Л., 1970. - С. 206 - 210).

Однако данный способ обеспечивает недостаточно высокий урожай целевого продукта: на протяжении десяти пассажей концентрация вируса в культуральной жидкости не превышала (в среднем) 5,18 lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Кроме того, получение первично-трипсинизированной культуры клеток ФЭП связано со значительными затратами материальных средства на приобретение эмбрионов перепелов из специализированного хозяйства со строго регламентированными условиями содержания перепелиного стада и периодическими обследованиями его на отсутствие целого ряда вирусных и микробных агентов. Получение вирусной биомассы на ФЭП сопряжено с определенной трудоемкостью приготовления клеточного субстрата и достаточно высокими производственными потерями (в производственном Регламенте предусматривается 20% брака).

Известен способ получения культуральной вакцины против кори, предусматривающий заражение вирусом-продуцентом диплоидной культуры клеток WI-38, полученной Хейфликом из легкого эмбриона человека, с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде. В качестве вируса-продуцента для получения коревой вакцины в этой клеточной культуре был использован коревой штамм Эдмонстон-Загреб, который длительно пассировали на тканевых культурах человека (Clements S.J. et al. Research into alternative measles vaccines in the 1990's.// World Health Organization, EPI/GEN/88.11).

Других технологических сведений, необходимых для культивирования зарубежных штаммов нами не обнаружено.

Более близким по сущности к заявляемому изобретению является способ получения культуральной коревой вакцины из штамма-продуцента Л-16, предусматривающий заражение указанной выше диплоидной культуры WI-38. Изучение реактогенных свойств серий вакцины показало их высокую реактогенность (7% сильных, 7% средних и 10% слабых температурных реакций) - Доссер Е.М., Рапопорт Р.И., Дорофеев В.М. и др. Изучение живой коревой вакцины, приготовленной в системе диплоидных клеток человека. - В кн.: Проблема профилактики кори и противовирусные препараты. - Материалы VII научной конференции. - М., 1966.-с.5 - 8. ВФС-42-179BC-88 "Вакцина коревая культуральная живая сухая" допускает наличие сильных температурных реакций у привитых не более 2%. Кроме того, поступление в Россию зарубежных клеточных линий, перспективных для производства вирусных препаратов, весьма ограничено, а создание генофонда таких клеток, обеспечивающих коммерческое производство, практически невозможно.

Несмотря на большое количество новых диплоидных линий и штаммов, у нас в стране имеется только одна линия диплоидных клеток человека Л-68 (А.св. 1210458), которая соответствует требованиям ВОЗ и зарегистрирована в качестве национальной для производства и контроля МИБП, в частности была использована для разработки и приготовления ряда профилактических препаратов против особо опасных инфекций. Однако, как будет показано в табл. 1, она оказалась недостаточно чувствительной к вакцинному штамму-продуценту Л-16B: максимальный урожай вируса составлял на протяжении трех пассажей 4,0 - 5,0 lg ТЦД₅₀/50 мл.

Изобретения направлены на разработку способа получения вируса кори и поддерживающей питательной среды для его культивирования, при этом повышен урожай и биологическая активность препаратов вируса кори, а также обеспечена достаточная чистота и стабильность получения качественного конечного продукта.

Сущность изобретения сводится к следующему.

Способ получения биомассы вируса кори предусматривает заражение диплоидной клеточной культуры вирусом кори с последующим культивированием в поддерживающей питательной среде. В качестве диплоидной клеточной культуры используют фибробласты легкого эмбриона человека - линия 385/13 (депонирована в базовом отделении Российской коллекции клеток в НИИ гриппа РАМН, РКК(ДП)004, авторы: Литвинчук Л.Ф., Лисок Т.П., Шитикова Г.С.). Линия получена из легкого 17-18-недельного нормального эмбриона человека и криоконсервирована на 5-м и 7-м пассажах. Культивируется статическим и роллерным способами, имеет фибробластоподобный тип роста, ограниченный 50 пассажами (срок жизни). Соответствие виду подтверждено кариологически; бактерии, грибы, микоплазмы не обнаружены; онкогенных потенций в тесте с использованием органной культуры кожи куриного эмбриона не выявлено.

Очевидно преимущество использования ФЛЭЧ для совершенствования технологии производства вакцины по сравнению с первично-трипсинизированными клеточными культурами почек новорожденных морских свинок и фибробластов японких перепелок - последние являются тканевой культурой для производства коревой вакцины в настоящее время (ВФС 42-179-BC-88): вследствие простоты и экономичности; всесторонней аттестованности в соответствии с требованиями ВОЗ в отношении онкогенной безопасности, отсутствия посторонних контаминантов и стабильности биологических свойств клеточной линии.

Спектр чувствительности диплоидных клеточных культур к вирусу кори разнообразен и межет меняться от используемого штамма вируса. Исследования, выполненные авторами, показали, что используемая ими в качестве субстрата для репродукции вируса кори диплоидная линия ФЛЭЧ 385/13 по чувствительности не уступает первичной клеточной культуре ФЭП, используемой в настоящее время для производства коревой вакцины. Концентрация вируса даже без предварительной адаптации к данной клеточной культуре достигает 4,24 - 5,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, а на последующих пассажах при использовании предложенного состава сред 6,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Некоторые диплоидные линии клеток, в которых отмечалась высокая репродукция вируса кори, оказались малопродуктивными вследствие нерегулярной воспроизводимости результатов и, следовательно, не пригодны для производства коревых вирусных препаратов. Линия ФЛЭЧ Л-68, зарегистрированная в качестве национальной линии для производства медицинских и биологических препаратов, оказалась мало чувствительной к вирусу кори, о чем свидетельствуют показатели репродукции вируса. На протяжении 4-х последовательных пассажей репродукционная активность вируса не превышала 5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

За счет использования диплоидной линии 385/13 удалось повысить биологическую активность препаратов вируса кори.

Поддерживающая питательная среда по первому варианту содержит среду 199 и аминопептид. Для повышения биологической активности препаратов вируса кори и повышения чистоты конечного продукта дополнительно вводили среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40 - 58
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40 - 58
Аминопептид - До 100
Согласно второму варианту к среде 199 добавлена среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот и аргинин при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40 - 59
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40 - 59
Аргинин - До 100
Исходная концентрация аргинина для приготовления питательной среды составляла 2,5%.

Для компенсации питательных веществ, содержащихся в сыворотке и позволяющих поддерживать репродукцию вируса кори на достаточно высоком уровне, используется включение таких компонентов, как аргинин, аминопептид и двукратное количество аминокислот в среде Игла МЕМ. Концентрация вируса в конечном продукте при этом достигает 5,75 - 6,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, что свидетельствует не только о компенсирующей роли вышеуказанных компонентов среды, но и об их стимулирующем действии на репродукцию вируса кори.

Способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Культивирование вируса кори в статических условиях.

Матрацы объемом 250 мл с клеточной культурой ФЛЭЧ 385/13 трижды отмывают от сыворотки (содержание сыворотки в ростовой среде - 10%) фосфатно-солевым буферным раствором, затем вносят по 5 мл поддерживающей питательной среды, содержащей расчетное количество вируса (множественность инфекции для штамма вируса кори Ленинград-16B составила 0,1 - 0,4 ТЦД₅₀/кл.), проводят адсорбцию вируса в течение 1 часа при 35^oC, после чего добавляют по 40,0 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из
среды Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 57%
среды 199 - 40%
2,5%-ного аргинина - 3%
и по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина. Матрацы с зараженными вирусом клетками инкубируют при температуре 34 - 35^oC, ежедневно регистрируя состояние монослоя, развитие цитопатогенного действия вируса. По мере нарастания цитопатогенных изменений клеточного монослоя, характерных для вируса кори, вируссодержащую жидкость сливают во флаконы и хранят под резиновой пробкой при -20^oC для последующего использования, а в матрацы добавляют по 50 мл свежей поддерживающей среды (состав указан выше). Такую процедуру многократно повторяют с интервалом 1 - 2 дня. При данных условиях число полезных съемов (циклов, в которых содержание вируса не менее 4 lg ТЦД₅₀/0,5 мл) составляет не менее 4. Все операции способа выполняют в стерильных условиях. Инфекционный титр вируса, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток L-41 (клоновый вариант), равен 5,5 - 6,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

Пример 2. Культивирование вируса кори в роллерных условиях.

1-литровые матрацы с клеточной культурой ФЛЭЧ 385/13 трехкратно отмывают от сыворотки, содержащейся в ростовой среде, фосфатно-солевым буферным раствором, вносят по 10 мл поддерживающей питательной среды, содержащей 0,1 - 0,5 ТЦД₅₀/кл вируса кори (штамм Ленинград-16B), проводят адсорбцию вируса в течение часа при 35^oC в роллерах при скорости вращения 0,3 об/мин. Далее в матрацы добавляют по 160 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из
среды Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 55%
среды 199 - 40%
аминопептида - 5%
и по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина. Дальнейшее культивирование вируса кори проводят в роллере при 35^oC и 0,3 об/мин в течение срока сохранения клеточной культуры. По мере нарастания цитопатогенных изменений клеточного монослоя делают сборы вируссодержащей жидкости с интервалом 1-2 дня до полной деструкции клеточного монослоя. Каждый съем вируссодержащей жидкости сопровождается добавлением в матрацы по 160 мг свежей указанного выше состава поддерживающей питательной среды. При данных условиях число полезных съемов не менее 5. Инфекционный титр вируса составляет 6,0 - 6,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл при титровании на перевиваемой культуре клеток L-41.

Пример 3. Приготовление поддерживающей питательной среды
(вариант 1)
В среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот добавляют двойное количество глютамина. Смешивают все ингредиенты в следующей последовательности: среда Игла МЕМ (55%), среда 199 (40%), аминопептид (5%). В готовую смесь добавляют по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина и вносят в матрацы с инфицированным монослоем.

Пример 4. Приготовление поддерживающей питательной среды
(вариант 2).

Для получения второго варианта поддерживающей питательной среды предварительно готовят 2,5% (вес%) раствор аргинина на фосфатно-солевом буферном растворе, стерилизуют фильтрованием через миллипоровые фильтры и хранят при +4^oC в течение 6 месяцев. В среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот добавляют двойное количество глютамина. Смешивают все ингредиенты в следующей последовательности: среда Игла МЕМ (57%), среда 199 (40%), 2,5% аргинин (10%). В готовую смесь добавляют по 250 мкг/мл стрептомицина и вносят в матрацы с инфицированным монослоем клеток.

Как видно из табл. 1, 2 и 3, диплоидная клеточная культура ФЛЭЧ 385/13 и предлагаемые составы поддерживающей питательной среды позволяют в 10 - 100 раз повысить урожай вируса кори по сравнению с первично-трипсинизированной культурой фибробластов эмбрионов перепелок (ФЭП) и другими диплоидными клеточными культурами, что дает возможность использовать описываемый способ для получения биомассы вируса кори на стабильном, тщательно отконтроливаронном и доступном клеточном субстрате и применения полученного вирусного полуфабриката в промышленном производстве вакцин и диагностических препаратов.

Изобретение предназначено для получения вакцинных и диагностических препаратов вируса кори. Способ получения вируса кори предусматривает заражение диплоидной клеточной культуры вирусом кори в поддерживающей питательной среде. В качестве диплоидной клеточной культуры используют фибробласты легкого эмбриона человека - ФЛЭЧ 385/13. Поддерживающая питательная среда для культивирования вируса кори по первому варианту имеет следующий состав, об. %: среда 199 40 - 58, среда Игла MEM с двойным содержанием аминокислот 40 - 58, аминопептид до 100. По второму варианту поддерживающая среда имеет состав, об. %: среда 199 40 - 59, среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот 40 - 59, аргинин до 100. Повышает урожай и биологическую активность препаратов вируса кори, а также обеспечивает достаточную чистоту и стабильность целевого продукта. 3 с.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения вируса кори, предусматривающий заражение диплоидной культуры вирусом кори в поддерживающей питательной среде, отличающийся тем, что в качестве диплоидной клеточной культуры используют фибробласты легкого эмбриона человека - ФЛЭЧ 385/13 (базовое отделение российской коллекции клеток ВНИИ гриппа РАМН, РКК (ДП) 004). 2. Поддерживающая питательная среда для культивирования вируса кори, содержащая среду 199 и аминопептид, отличающаяся тем, что дополнительно содержит среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот при следующем соотношении ингредиентов, об%:
Среда 199 - 40 - 58
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40 - 58
Аминопептид - До 100
3. Поддерживающая питательная среда для культивирования вируса кори, содержащая среду 199, отличающаяся тем, что дополнительно содержит среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот и аргинин при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40 - 59
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40 - 59
Аргинин - До 100