СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ КОРЕВОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/165 A61K9/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вирусных вакцинных препаратов в капсулированной форме.

Известен способ получений живой коревой вакцины (ЖКВ) на основе любого вакционного штамма. Способ включает культивирование вируса в культуре клеток эмбрионов японских перепелов, сбор вируссодержащей жидкости, введение стабилизатора и высушивание [1] . Вакцина индуцирует синтез гемагглютинирующих антител в организме человека и животных и обеспечивает протективный эффект. Стабилизатор содержит сорбит и желатозу.

Наиболее близким способом (прототипом) является традиционная технология получения ЖКВ путем размножения аттенуированного штамма Л-16 вируса кори на культуре фибробластов японских перепелов с последующим сбором вируссодержащей жидкости и ее очисткой при помощи фильтрации или центрифугирования. В полученную субстанцию вводят стабилизатор, включающий сорбит и желатозу в конечной концентрации 5% или ЛС-18 и желатин. Продукт разливают в ампулы, лиофильно высушивают с последующей герметизацией ампул [2]. Перед применением вакцину разводят растворителем. Биологическая активность ЖКВ составляет 3,3 - 4,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

Недостатками известных способов (аналога и прототипа) получения ЖКВ [1, 2] является инъекционная форма применения ЖКВ, что создает угрозу заражения вирусами гепатита и ВИЧ при вакцинации, а также необходимость в специально оборудованных помещениях, большом количестве шприцов и игл, квалифицированном персонале для проведения вакцинаций и ревакцинаций.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка такого способ получения ЖКВ, который позволил бы изготавливать ЖКВ в капсулированной форме для перорального применения с использованием простого и экономичного технологического оборудования.

Указанная задача решается тем, что в способе получения живой коревой вакцины, включающем размножение вируса кори на клеточном субстрате, сбор вируссодержащей жидкости, освобождение продукта от клеточного детрита, введение в него стабилизирующего состава с последующей лиофилизацией препарата, согласно изобретению сбор вируссодержащей жидкости осуществляют при достижении титра вируса не менее 5,0 - 6,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл и содержании белка не более 16 мкг/мл, в качестве стабилизирующего состава в вируссодержащую жидкость вводят сорбит, сахарозу, желатозу и пептон до конечной их концентрации в смеси 0,8 - 1,2; 2,5 - 3,5; 2,5 - 3,5; 2,5 - 3,5 соответственно (мас.%) каждого компонента стабилизатора, после лиофилизации сухой вируссодержащий материал измельчают. Полученной массой заполняют капсулы, которые покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы.

Предлагаемый состав стабилизатора обеспечивает оптимальные условия для сохранения активности вируса кори в процессе лиофильной сушки с получением однородной матрицы с максимальной температурой стеклования. Кроме того, обеспечивается сохранение титра вируса кори в процессе его хранения и использования в препаративной форме.

При использовании стабилизирующего состава в количестве, меньшем, чем нижняя граница указанного интервала количественного содержания каждого компонента стабилизатора, значительно снижается титр вируса кори в процессе сушки.

При использовании стабилизирующего состава в количестве, большем, чем верхняя граница указанного интервала количественного содержания каждого компонента стабилизатора, значительно снижается температура стеклования препарата (меньше +40^oC) в процессе сушки. При этом получают матрицу низкого качества и недостаточной термостабильности.

Вакцина, приготовленная предлагаемым способом, обладает выраженными иммуногенными свойствами, проверенными экспериментально на лабораторных животных. При производстве вакцины исключаются дорогостоящие и трудоемкие этапы подготовки и стерилизации ампул, розлива вакцины в ампулы, их герметизации, приготовления и контроля растворителя, вследствие чего освобождается ряд производственных помещений и оборудования. Новая форма выпуска вакцины исключает возможность заражения вирусами гепатитов и ВИЧ при вакцинации, необходимость в оборудовании помещений для профилактических прививок, обеспечении инструментами, квалифицированным персоналом.

Совокупность существенных признаков предлагаемого изобретения, отличающихся от существенных признаков прототипа, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "изобретательский уровень".

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление капсулированной формы ЖКВ.

Культуру клеток фибропластов японских перепелов получают путем трипсинизации эмбрионов раствором трипсина-версена при 37^oC. Клеточную взвесь центрифугируют, клетки ресуспендируют в ростовой среде и рассеивают в матрасы или роллеры из расчета 500 и 950 тыс. кл./мл соответственно. Выращивание проводят при 35^oC до образования монослоя. При суспензионном заражении вирус добавляют во взвесь клеток с множественностью заражения 0,1 - 0,001 ТЦД₅₀/кл. После образования монослоя клетки подвергают 6-кратным отмывкам для освобождения от балластных белков, далее культивируют при температуре (35 ± 1)^oC и частоте вращения роллеров 2 - 12 об/мин. При появлении цитопатического действия вируса на клетки осуществляют сбор вируссодержащей жидкости с интервалом 1 - 3 суток с последующей заменой поддерживающей среды. Индивидуальные вирусные сливы с биологической активностью не ниже 5,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл объединяют и освобождают фильтрованием от клеточного детрита. В полученную суспензию добавляют стерильные растворы 50%-ного сорбита, 50%-ной сахарозы, 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) и 25%-ного пептона до конечной концентрации 0,8 - 1,2; 2,5 - 3,5; 2,5 - 3,5; 2,5 - 3,5 мас.% каждого компонента соответственно. Состав разливают в лотки по 1 л (толщина слоя жидкости 0,5 см) и замораживают при температуре -60^oC в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Высушенный вируссодержащий материал измельчают. Полученной массой заполняют капсулы (по 120 мг), которые затем покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы. Полученную вакцину контролируют по физико-химическим свойствам, содержанию посторонней микрофлоры, биологической активности, безвредности, антигенности, иммуногенности (на лабораторных животных).

Пример 2. Результаты оценки физико-химических свойств капсул ЖКВ,
Контроль капсулированной формы ЖКВ по физико-химическим свойствам проводят в соответствии с [2], остаточную влажность определяют по методу [3]. Средняя масса содержимого капсулы составляет 0,11 - 0,13 г, остаточная влажность содержимого капсул - (1 - 3)%. Капсулы имеют гладкую поверхность без повреждений и видимых воздушных и механических включений. Капсулы не распадаются в течение 60 минут в 0,1 N растворе соляной кислоты при 37^oC и распадаются в растворе натрия бикарбоната (pH от 7,5 до 8,0) в течение 1 часа (17^oC).

Пример 3. Определение специфической активности препарата.

Для определения специфической активности содержимое капсулы растворяют в питательной среде, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 25 минут и титруют в 96-клеточных культуральных планшетах на культуре клеток VERO по цитопатическому действию в соответствии с [2]. Специфическая активность капсулированной формы ЖКВ составляет 4,0 - 4,45 lg ТЦД₅₀/капс.

Пример 4. Определение содержания посторонней микрофлоры в ЖКВ.

Методику проведения анализа на содержание в капсулах ЖКВ посторонней микрофлоры осуществляют в соответствии с ФС [4].

Содержание посторонних микроорганизмов составляет 1 - 5 колоний на капсулу. Патогенных бактерий кишечной группы, золотистого стафилококка, синегнойной палочки не обнаружено.

Пример 5. Исследование препарата ЖКВ на токсичность.

Токсичность для лабораторных животных определяют в соответствии с методикой [5] . Содержимое капсулы растворяют в физиологическом растворе (5 мл/капс). Раствор вводят подкожно по 5 мл двум беспородным морским свинкам в возрасте 3 месяцев с массой тела 300 ± 50 г и по 0,2 мл пяти беспородным белым мышам в возрасте 2 месяца с массой тела 17 - 20 г. Все животные остались живы в течение 7 суток, масса каждого животного не уменьшилась по сравнению с исходной на день окончания экспериментов, на месте введения не развился абсцесс или некроз, не отмечено повышения температуры ни у одного животного.

Пример 6. Исследование иммуногенности препарата на животных.

Контроль иммуногенности препарата осуществляют на чувствительной модели животных - обезьянах макаках-резус. Животных иммунизируют капсулированной ЖКВ в дозе - 100000 ТЦД₅₀ двухкратно через 10 дней. На 0, 1, 3, 5, 7, 9, 14, 21, 28, 48 день осуществляют забор крови у вакцинированных животных. Кровь исследуют на наличие антител в реакции торможения гемаглютинации (РТГА), иммуноферментным методом (ИФА). Специфический клеточный иммунный ответ оценивают в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с антигеном вируса кори, секреторный иммунный ответ - по нарастанию титров секреторных антител в слюне.

В качестве контроля используют ЖКВ для инъекционного применения. Как видно из представленных в таблице результатов, капсулированная форма вакцины вызывает у обезьян выраженную индукцию гуморального ответа, сравнимого с ответом на введение традиционной ЖКВ. При введении капсулированной формы вакцины дополнительно формируется секреторный иммунный ответ, что является преимуществом пероральных форм препаратов.

Экспериментальные исследования показывают, что приготовление капсулированной формы ЖКВ на основе сухого вируссодержащего препарата (активность 4,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл), полученного по традиционной технологии [1, 2] (со стабилизатором сорбит с желатозой или ЛС-18 с желатином) не технологично (материал плохо измельчается), и из-за гигроскопичности материала в капсулах происходит полное падение биологической активности в течение 1 месяца при 4^oC. Предлагаемая технология получения капсулированной формы ЖКВ с использованием нового состава стабилизатора обеспечивает сохранение биологической активности вируссодержащего препарата.

Промышленная применимость.

Источники научно-технической и патентной информации
1. Авторское свидетельство СССР N 278964, C 12 K 5/00, 1973.

2. Вакцина коревая культуральная живая, сухая. ФС 42-3092 94.

3. Государственная Фармакопея СССР. - М.: 1987, 11 изд. в. 2, с. 156.

4. Там же, с. 196 - 209.

5. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности МИБП. Приказ МЗ СССР N 31 от 13.01.83.0

Изобретение относится к области медицины, в частности к производству вирусных вакцинных препаратов в капсулированной форме. Способ позволяет изготавливать живую коревую вакцину в капсулированной форме для перорального применения с использованием простого и экономичного технического оборудования. Способ получения живой коревой вакцины включает размножение вируса кори на клеточном субстрате, сбор вируссодержащей жидкости, освобождение продукта от клеточного детрита, введение в него стабилизирующего состава с последующей лиофилизацией препарата. Сбор вируссодержащей жидкости осуществляют при достижении титра вируса не менее 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл и содержании белка не более 16 мкг/мл, в качестве стабилизирующего состава в вируссодержащую жидкость вводят сорбит, сахарозу, желатозу и пептон до конечной их концентрации в смеси 0,8-1,2; 2,5-3,5; 2,5-3,5; 2,5-3,5 (мас.%) каждого компонента стабилизатора соответственно. После лиофилизации сухой вируссодержащий материал измельчают, помещают в капсулы, которые покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы. Изобретение расширяет арсенал вакцинных препаратов для лечения и профилактики кори. 1 табл.

Способ получения живой коревой вакцины, включающий размножение вируса кори на клеточном субстрате, сбор вируссодержащей жидкости, освобождение продукта от клеточного детрита, введение в него стабилизирующего состава с последующей лиофилизацией препарата, отличающийся тем, что сбор вируссодержащей жидкости осуществляют при достижении титра вируса не менее 5 - 6 lg ТЦД₅₀/0,5 мл и содержанием белка не менее 16 мкг/мл, в качестве стабилизирующего состава в вируссодержащую жидкость вводят сорбит, сахарозу, желатозу и пептон до конечной их концентрации в смеси 0,8 - 1,2; 2,5 - 3,5; 2,5 - 3,5; 2,5 - 3,5 (мас.%) каждого компонента стабилизатора соответственно, после лиофилизации сухой вируссодержащий материал измельчают, помещают в капсулы, которые покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы.