СПОСОБ СИНГЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОСТНОГО МОЗГА В БРЫЖЕЙКЕ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к экспериментальной гематологии и касается методов изучения регенераторной способности костного мозга in vivo.

Известен способ культивирования экстрамедуллярного очага кроветворения под капсулой почки (А.Я.Фриденштейн, А.Я.Лурия, "Клеточные основы кроветворного микроокружения", Москва, 1980). Однако данный способ не позволяет проследить динамику процесса роста костного мозга in vivo, а только на умерщвленном животном. Проведение световой микроскопии также не представляется возможной при имплантации очага гемопоэза под капсулу почки. Кроме того, хирургический доступ представляет собой довольно трудоемкую и длительную операцию, а во-вторых, подведение источника освещения для проведения световой микроскопии практически крайне затруднено при указанной локализации очага гемопоэза.

Целью изобретения является создание способа наблюдения за процессами роста и регенерации ткани костного мозга in vivo.

Поставленная цель достигается тем, что суспензию клеток из костно-мозгового канала, в отличие от прототипа, имплантируют в брыжейку тонкого кишечника экспериментального животного, что:
1. Позволяет визуально оценить жизнеспособность культивируемого очага (чего нет при пересадке клеток под капсулу почки);
2. Позволяет проводить световую микроскопию трансплантированного очага кроветворения, что в принципе невозможно при пересадке костного мозга под капсулу почки в связи с особенностями анатомического строения указанных органов;
3. Обеспечивает возможность проведения прижизненного динамического контроля на любых сроках эксперимента, что отличается от локализации очага под капсулой почки, когда гистологическое исследование трансплантированной ткани костного мозга производится только после забоя экспериментального животного.

Сравнение заявляемого решения с известным показывает, что впервые предложено введение клеток костного мозга в брюшную полость животного, что позволяет проследить динамику регенерации ткани костного мозга in vivo. С учетом изложенного следует считать заявляемое решение соответствующим критерию "существенные отличия".

Предлагаемый "Способ сингенного культивирования костного мозга в брыжейке тонкого кишечника" соответствует критерию новизны, так как, в отличие от прототипа, позволяет на основании выраженного различия цвета брыжейки и ткани костного мозга визуально оценить жизнеспособность трансплантата, благодаря анатомическим особенностям брыжейки дает возможность легко проводить световую микроскопию очагов гемопоэза, а также обеспечивает возможность наблюдения за процессом регенерации очага гемопоэза в динамике in vivo.

Данные отличительные действия в медицине неизвестны, на основании чего можно сделать вывод о соответствии предлагаемого способа изобретательскому уровню.

Способ осуществляется следующим образом. Механически удаляют шерстяной покров с передней брюшной стенки кролика и с внутренней поверхности коленного сустава его нижней конечности. Затем эти участки очищенной от шерсти кожи обрабатываются 5%-ным спиртовым раствором йода. Состояние наркоза достигается внутримышечным введением 1,0 калипсола. Затем из эпифиза бедренной кости с помощью пункционной иглы диаметром 1 мм производится забор 2-3 мл содержимого костно-мозгового канала. На следующем этапе эксперимента производится срединная лапаротомия с доступом к брыжейке тонкого кишечника. Сингенные клетки костного мозга в объеме 0,3 - 0,4 мл инъецируются между листками брыжейки, создавая инфильтраты вблизи сосудистых аркад.

Через 4 - 5 недель под калипсоловым наркозом производится повторная лапаротомия с доступом к брыжейке тонкого кишечника. Петли кишки вместе с участками брыжейки, содержащей очаги гемопоэза, выводятся в полость специально сконструированной камеры, где проводится световая микроскопия, а также видео- и фотосъемка. Все эти данные в последующем подтверждаются гистологическими исследованиями.

Нами проведено исследование по культивированию экстрамедуллярного очага кроветворения путем подсадки клеток сингенного костного мозга в брыжейку тонкого кишечника на 21 кролике обоего пола массой от 5,8 кг до 7,2 кг. При повторной лапаротомии через 4 и 5 недель сразу же визуально отмечались красно-розовые очаги гемопоэза на фоне белесоватой брыжейки, отмеченные с прототипом различия сразу же фиксировались с помощью видео- и фотосъемки. Участки тонкого кишечника вместе с брыжейкой резецировались, культивированная культура костного мозга подвергалась гистологическому исследованию. Вся совокупность данных давала представление о динамике роста и регенерации костного мозга. После послойного ушивания раны и обработки передней брюшной стенки кролика раствором йода животное находилось в условиях стационарного вивария на стандартном пищевом рационе при свободном доступе к воде. Повторные лапаротомии проводились еще через 1 и/или 2 недели. Все полученные данные говорят о том, что способ применим и эффективен.

Таким образом, применение заявляемого способа создает возможности для динамического наблюдения за процессами роста и регенерации ткани костного мозга в условиях in vivo.

Способ может быть использован в медицине, а именно в экспериментальной гематологии, и касается методов изучения регенераторной способности костного мозга in vivо. У экспериментального животного путем чреcкостной пункции в области площадки бедра из костно-мозгового канала берут 2-3 мл цельного костного мозга в шприц с гепарином. Тотчас же животному производят срединную лапаратомию с доступом к брыжейке тонкого кишечника. Тонкой инъекционной иглой между листками брыжейки вводят клетки костного мозга. Операционные раны ушивают послойно. Результаты эксперимента оценивают гистологически, путем видео и фотосъемки и световой микроскопии через установленные сроки наблюдения. Способ позволяет создавать возможности для динамического наблюдения за процессами роста и регенерации ткани костного мозга в условиях in vivо.

Способ сингенного культивирования клеток костного мозга, включающий забор содержимого костно-мозгового канала, отличающийся тем, что у экспериментального животного производят срединную лапаротомию, а клетки из костно-мозгового канала имплантируют в брыжейку тонкого кишечника.