СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОПЕПТИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C07K9/00 C07J53/00 

Изобретение относится к способу получения свободных тритерпеновых гликопептидов производных глицирризиновой кислоты (ГК) (I) общей формулы (II), представляющих интерес для медицины в качестве иммуномодуляторов и анти-ВИЧ средств

Известен способ получения карбокси-защищенных гликопептидов ГК, состоящий в конденсации гликозида (карбокси-компонент) с эфирами аминокислот (метиловыми и трет-бутиловыми),

взятыми в виде их гидрохлоридов (аминокомпонент) (АК) с помощью N-гидроксисукцинимида (HOSu)-N, N'-дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) в среде тетрагидрофурана или диоксана в присутствии триэтиламина (ТЭА) (прототип), с последовательным выдерживанием реакционной массы при температуре 0-5^oC 3 ч, комнатной 6 ч, 4-8^oC 12 ч с последующим взаимодействием образовавшегося трисоксисукцинимидного эфира с АК при 0-5^oC и выдерживанием реакционной массы при комнатной температуре 24 ч при молярном соотношении реагентов ГК/HOSu/ДЦГК/АК/OCH= 2/10-10,4/6-6,4/6-7/9,8-10,8 ммоль, выход карбоксизащищенных гликопептидов ГК (IY) 46-86% (схема 1).

Недостатком данного способа является протекание побочной реакции образования сукцинимидоксикарбонил β аланина, что снижает выход целевых продуктов (в данном случае гликопептидов ГК):

Кроме того, основным недостатком предложенного нами ранее способа является использование в качестве реагента (аминокомпонента) эфиров аминокислот или дипептидов в виде солей (HCI), в результате чего конечным продуктом реакции являются карбоксизамещенные гликопептиды формулы (IY), содержащие фрагменты метиловых и трет-бутиловых эфиров аминокислот или дипептидов. Для получения полностью деблокированных гликопептидов формулы (II), где R-фрагменты свободных аминокислот, необходимо проведение дополнительной стадии синтеза, связанной с уделением карбоксизащитных сложноэфирных групп:
а) обработка трифторуксусной кислотой в случае трет-бутиловых эфиров;
б) щелочной гидролиз (КОН или NaOH в метаноле) в случае метиловых эфиров.

Как показали наши исследования, деблокирование защищенных гликопептидов ГК, содержащих фрагменты метиловых эфиров аминокислот, путем щелочного гидролиза приводит к сложной смеси продуктов в результате расщепления гликозидных связей. При обработке трифторуксусной кислотой гликопептидов ГК, содержащих фрагменты трет-бутиловых эфиров аминокислот, выходы свободных гликопептидов составили 43-47% (примеры 8, 9). В качестве примера мы приводим две методики получения целевых гликопептидов (IVд,з) по способу-прототипу. Поэтому получение свободных тритерпеновых гликопептидов ГК формулы (II), представляющих интерес для медицины в качестве потенциальных иммуномодулирующих и антивирусных средств, пригодных для получения инъекционных форм, является актуальной задачей. В предложенном техническом решении упрощена технология получения свободных гликопептидов ГК формулы II, благодаря принципу "минимальной защиты", исключающей процесс деблокирования.

Гликопептиды ГК формулы (II) образуются в результате конденсации активированного интермедиата КГ (VI) с аминокислотами или дипептидами в среде ДМФА в присутствии 1N раствора NaOH. Для получения активированного эфира ГК (VI) (схема 2) ГК обрабатывают комплексом F (комплекс пентафторфенола с N, N'-дициклогексилкарбодиимидом состава 3: 1) (У) при 0-5^oC в ДМФА. Молярное соотношение реагентов ГК /комплекс F/ аминокомпонент равно 1/3/3-4 ммоль

Способ состоит в том, что глицирризиновую кислоту (I) (1 ммоль) обрабатывают при 0 -5^oC при перемешивании комплексом F (3 ммоль) в среде ДМФА в течение 1 ч, при комнатной температуре 4ч, получая активированный интермедиат (VI), который после отделения осадка N, N' -дициклогексилмочевины подвергают взаимодействию с аминокомпонентом (АК) (аминокислотами или дипептидами) формулы RNH ₂, где




в среде ДМФА в присутствии 1N раствора NaOH при молярном соотношении реагентов ГК/комплекс F/AK, равном 1/3/3-4 ммоль при 0^oС с последующим выдерживанием реакционной смеси при комнатной температуре в течение 24 ч. Целевые гликопептиды П (а-ж) выделяют путем разбавления реакционной смеси колодной водой и подкисления лимонной кислотой до pH≈3. Полученный осадок отфильтровывают и переосаждают из смеси хлороформ метанол (5:1) эфиром. Выход гликопептидов (П а-ж) составил 62,5-90,9% После очистки колоночной хроматографией выход продуктов составляет 44,4-57,9%
Отличия предлагаемого способа следующие.

1. Для активации карбоксильных групп глицирризиновой кислоты используется комплекс F (схема 2) вместе N гидроксисукцинимида (HOSu) N, N' -дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) в известном способе [4] (схема 1). В качестве активированного интермедиата образуется при этом трис-пентафторфениловый эфир ГК (VI).

2. В качестве растворителя используется N, N -диметилформамид (ДМФА).

3. В качестве аминокомпонента (АК) используются свободные аминокислоты или дипептиды.

4. В качестве основания используется 1N раствор NaOH вместо третичного амина (триэтиламин) в известном способе.

Пример 1. Трис-пентафторфениловый эфир глицирризиновой кислоты (VI).

К раствору 0,82 г (1 ммоль) глицирризиновой кислоты в 30 мл диметилформамида (ДМФА) при 0^oC прибавили при перемешивании 2,28 г (3 ммоль) комплекса F и перемешивали смесь при этой температуре 1 ч, при комнатной температуре (20-22^oC) 4 ч. Выдерживали реакционную смесь в холодильнике (4 -8^oC) в течение ночи и отфильтровывали осадок дициклогексилмочевины. Полученный раствор пентафторфенилового эфира ГК (VI) использовали в реакции конденсации с аминокомопнентами.

Пример 2. 3-0-2-0-[N-(β) D-глюкопиранозил уронол)- L -аланин -N-(b- D-глюкопиранозилуроноил) L -аланин} (3β, 20β), -11-оксо-30-(N-карбонил-L-аланин) -30- норолеан- 12-ен (llа).

К раствору 0,36 г (4 ммоль) L аланина в 10 мл I N раствора NaOH прибавили 10 мл ДМФА, охладили до 0^oC и при перемешивании прибавили по каплям раствор пентафторфенилового эфира ГК (VI) (1 ммоль) в 30 мл ДМФА (пример 1), перемешивали смесь 30 мин при охлаждении и выдерживали при комнатной температуре 24 ч с периодическим перемешиванием. Разбавили реакционную смесь 200 мл холодной водой, подкислили лимонной кислотой до pH≈3. Выпавший осадок отфильтровали, промывали водой и высушили. Получили 1,03 г (99,4%) сырого гликопептида llа, который переосадили из смеси хлороформа метанола (5:1, Y/Y) эфиром. Выход 0,8 г (77,2%). Rf 0,47 (Хлороформ метанол-вода, 45:10:1); [α]20D

+55^° (с0,02; MeOH). Аналитически чистый образец 0,6 г 57,9% получили колоночной хроматографией на силикагеле L при элюировании системой хлороформ-метанол-вода, 100:10:1.

ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (OH,NH); 1720 (COOH); 1670 (C₁₁ 0); 1540 (CONH). УФ-спекр, λMeOHmax

, нм, (lgε) 248,5 нм (4,00). Найдено, C 58,93; H 7,10; N 3,74. C₅₁H₇₇N₃O₁₉. М.в. 1036,3. Вычислено, C 59,11; H 7,50; N 4,05.

Пример 3. 3-0-{ 2-0-[N-(b-D-глюкопиранозиоуроноил)-L-валин] -N- (b-D-глюкопиранозилуроноил)-L валин} 3β, 20β-11-оксо-30-(N-карбонил -L-валин)-30-норолеан -12- ен (llб).

К раствору 0,35 г (3 ммоль) L-валина в 10 мл IN раствора NaOH прибавили 10 мл ДМФА, охладили до 0^oC и при перемешивании прибавили по каплям раствор 1 ммоль пентафторфенилового эфира ГК (VI)(пример 1) в 30 мл ДМФА, перемешивали смесь при 0^oC 30 мин и выдержали при комнатной температуре 24 ч. Разбавили реакционную смесь 200 мл холодной водой, подкислили лимонной кислотой до pH≈ 2. Осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Получили 1,12 г (91,1% ) сырого гликопептида (llб), который переосадили из ацетона гексаном. Выход 0,9 г (80,4%). Rf 0,5 (хлороформ-метанол-вода, 45:10:1); [α]20D

+42,5^° (с 0,02; MeOH). Аналитически чистый образец 0,56 г (50%) получили колоночный хроматографией аналогично llа. ИК-спекр, ν см ^-1 : 3600-3200 (OH, NH); 1710 (COOH); 1670 (C₁₁ 0); 1530 (CONH), УФ-спектр, λMeOHmax нм (lgε): 248 нм (3,93). Найдено, C 61,46; H 7,96; N 3,23; C₅₇H₈₉N₃O₁₉. М.в. 1120,49. Вычислено, C 61,09; H 8,02; N 3,75.

Пример 4. 3-0-{2-0-[N-( b -D-глюкопиранозилураноил)-L -метионин]-N-( b -D-глюкопиранозилуроноил)-L-метионин} (3β, 20β) -II- оксо-30-(N-карбонил-L-метионин)-30-норолеан-12-ен (llв).

К раствору 0,58 г (4 ммоль) L-метионина в 10 мл ДМФА прибавили 10 мл 1N раствора NaOH, охладили до 0^oC и при перемешивании прибавили по каплям раствор 1 ммоль пентафторфенилового эфира ГК (VI) в 30 мл ДМФА (пример 1). Перемешивали реакционную смесь при этой температуре 24 ч. Разбавили смесь 200 мл холодной воды, подкислили лимонной кислотой до pH≈3. Осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Получили 1,07 г (87,7%) сырого гликопептида (llв), который переосадили из смеси хлороформа метанола (5:1) эфиром. Выход 0,86 г (70,0% ), Rf 0,56 (хлороформ-метанол-вода, 45:10:1); [α]20D

+34^° (c 0,02; MeOH). Аналитически чистый образец получен колоночной хроматографией аналогично llа.

ИК-спектр, ν, см^-1 3600-3200 (OH, NH); 1715 (COOH); 1660 (C₁₁=0); 1530 (CONH). УФ-спектр, λMeOHmax

нм (lgε): 249 нм (3,92). Найдено, C 56,18; H 7,32; N 2,82. C₅₇H₈₉N₃O₁₉S₃. М.в. 1216,48. Вычислено, C 56,27; H 7,37; N 3,45.

Пример 5. 3-0-{ 2-0-[N- β D-глюкопиранозилуроноил)-L-изолейцин]-N- b -D- глюкопиранозилуроноил)-L-изолейцин ( 3β, 20β )-II- оксо-30-(N-карбонил-L-изолейцин) -30- норолеан-12-ен (llг).

К раствору 0,52 г (4 ммоль) L изолейцина в 10 мл ДМФА, охлажденному до 0^o, прибавили 10 мл 1N раствора NaOH и при перемешивании прибавили по каплям раствор 1 ммоль пентафторфенилового эфира ГК (VI) в 30 мл ДМФА (пример 1). Смесь перемешивали 30 мин при 0^oC и выдерживали с периодическим перемешиванием при комнатной температуре 24 ч. Разбавили смесь 200 мл холодной воды, подкислили лимонной кислотой до pH≈3. Осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Получили 1,14 г (98,3%) гликопептида (llг), который переосадили из ацетона-гексаном. Выход 1,0 г (86,2%). Аналитический чистый образец получен с выходом 0,6 г (51,8%) колоночной хроматографией аналогично llа. Rf 0,5 (хлороформ-метанол-вода, 45:10:1). [α]20D

+45^° (с 0,02; MeOH);
ИК-спектр, ν см^-1: 3600-3200 (OH, NH); 1720 (COOH); 1660 (C₁₁=0); 1530 (CONH). УФ-спектр, λMeOHmax нм (lgε): 248 нм (4,10). Найдено, C 61,76; H 8,14; N 3,57. C₆₀ H₉₅ N₃O₁₉. М.в. 1162,5. Вычислено, C 61,59; H 8,25; N 3,61.

Пример 6. 3-0-{ 2-0-[N-(b-D-глюкопиранозилуроноил)-L-глутаминовая кислота]-N-(b-D-глюкопиранозилуроноил)-L-глутаминоваякислота}-(3β, 20β)-11-оксо-30-(N-карбонил -β- глутаминовая кислота) -30- норолеан-12 ен (llд).

К раствору 0,59 г (4 ммоль) L глутаминовой кислоты в 10 мл ДМФА, охлажденному до 0^oC, прибавили 20 мл 1N раствора NaOH и при перемешивании по каплям раствор 1 ммоль пентафторфенилового эфира ГК (VI) в 30 мл ДМФА (пример 1). Смесь выдержали с периодическим перемешиванием при комнатной температуре 24 ч и разбавили 300 мл холодной воды, подкислили лимонной кислотой до pH≈3. Осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Получили 1,20 г (99,1% ) сырого гликопептида (llд), который переосадили из смеси хлороформ-метанола (5: 1) эфиром. Выход 1,1 г (90,9%). Rf 0,49 (хлорофом-метанол-вода, 45:10:1). [α]20D

+49^° (с 0,02; MeOH).

ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (OH, NH); 1710 (COOh); 1660 (C₁₁=0); 1530 (CONH). УФ-спектр, λMeOHmax

, нм (lgε); 248 нм (4,07). Найдено, C 57,06; H 7,23; N 3,52. C₅₇H₈₃N₃O₂₅. М.в. 1210,4. Вычислено, C 56,56; H 6,93; N 3,47.

Пример 7. 3 -0-{2-O-(N- (β -D-глюкопиранозилуроноил)-глицин-L- фенилаланин] -N-(b-D-глюкопиранозилуроноил)-глицин-L-фенилаланин} (3β, 20β)-11-оксо-30-(N-карбонил -глицин-L-фенилаланин) -30- норолеан-12-ен llж).

К раствору 0,89 г (4 ммоль) глицил-L фенилаланина в 10 мл 1N NaOH, охлажденному до 0^oC, прибавили 10 мл ДМФА и по каплям раствор 1 моль пентафторфенилового эфира ГК (У) в 30 мл ДМФА (пример 1). Смесь перемешивали 30 мин при 0^oC и выдерживали с периодическим перемешиванием при комнатной температуре 24 ч. Смесь разбавили 300 мл холодной воды, подкислили лимонной кислотой до pH≈2-3. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Получили 1,21 г (84,0%) сырого гликопептида (llж), который переосадили из смеси хлороформа-метанола (5:1) эфиром. Выход 0,9 г (62,5%). Аналитический чистый образец получен колоночной хроматографией аналогично llа с выходом 0,64 г (44,4% ). Rf 0,45 (хлороформ-метанол-вода, 45:10:1). [α]20D

+35^° (с 0,02; MeOH).

ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (OH, NH); 1720 (COOH); 1660 (C₁₁=0), 1540 (CoNH). УФ спектр, λMeOHmax

, нм (lgε); 245 нм (3,95). Найдено, C 61,74; H 7,51; N 5,55. C₇₅H₁₀N₆O₂₂. М.в. 1438,76. Вычислено, C 62,61; H 7,09; N 5,84.

Пример 8. 3-0-{2-0-[N-(β)-D-глюкопиранозилуроноил) -L-изолейцина трет-бутиловый эфир] -N-(b-D- глюкопиранозилуроноил)-L -изолейцинатрет-бутиловый эфир} (3β, 20β) 11,30 диокси-30-L-изолейцина трет -бутиловый эфир -30-норолеан-12-ен (IVd).

1. К раствору 1,64 г (2 ммоль) глицирризиновый кислоты в 50 мл диоксана при 0-5^oC прибавили 1,2 г (10,4 ммоль )HOSu, 1,3 г (6 ммоль) ДЦГК и перемешивали при этой температуре 3 ч, при комнатной 6 ч. Выдержали смесь в течение ночи в холодильнике, отфильтровывали осадок дициклогексилмочевины и к фильтрату, охлажденному в бане со льдом, прибавили 1,5 г (6 ммоль) гидрохлорида третбутилового эфира L-изолейцина и 1,3 мл (9,5 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при охлаждении 1 ч и выдержали при комнатной температуре 24 ч. Растворитель упарили в вакууме при ≈45^oC, остаток растворили в хлористом метилене (200 мл) и промыли 5% раствором лимонной кислоты, водой, 5%-ным раствором NH₄OH и снова водой. Сушили над MgSO₄ упарили растворитель в вакууме при ≈30^oC. Получили 2,0 г (75,2%) сырого защищенного продукта (IVd), который переосадили из ацетона-гексана. Выход 1,28 г (48,1% ). Rf 0,66 (хлороформ-метанол-вода 45:10:1); 0,36 (хлороформ-спирт, 10:1). [α]20D

+29^° (с 0,086; εtOH),
ИК-спектр; ν, см^-1; 3600-3200 (OH, NH); 1740 (COOR); 1660 (C₁₁=0); 1530 (CONH). УФ-спектр, λetOHmax, (lgε): 246 нм (3,93). Найдено, C 64,86; H 8,96; N 3,52. C ₇₂ H₁₁₉N₃O₁₉. Вычислено, C 64,98; H 9,01; N 3,16.

Деблокирование защищенного гликопептида (IYд).

1,0 г (0,86 ммоль) защищенного гликопептида (IYд) в 20 мл CF₃COOH выдержали 30 мин при 20-22^oC и упарили смесь в вакууме досуха. Остаток (0,9 г) хроматографировали на колонке с силикагелем L (40/100 мкм/, элюируя смесью хлороформ метанол-вода, 200:10:1, 100:10:1, 50:10:1, 25:10:1. Смесью 50:10:1 вымывали 0,5 г (43%) гомогенного продукта (llг) в виде аморфного вещества. Rf 0,48 (хлороформ-метанол вода, 45:10:1); [α]20D

+55^° (с 0,015; εtOH).

Пример 9. 3-0-{2-0-[N-(β-Д- глюкопиранозилуроноил)-L-валина трет-бутиловый эфир] -N-(b-Д- глюкопиранозилуроноил)-L-валина трет-бутиловый эфир} (3β, 20β) 11,30 диоксо-30-L-валина трет-бутиловый эфир-30-норолеан-12-ен (VIз).

К раствору 1,64 г (2 ммоль) глицирризиновой кислоты в 50 мл сухого диоксана при 0-5^oC прибавили 1,2 г (10,4 ммоль) HOSu 1,4 г (6,4 ммоль) ДЦГК и перемешивали смесь при этой температуре 3 ч, при комнатной (20-22^oC) 6 ч. Выдержали смесь в течение ночи при 4-6^oC в холодильнике, осадок дициклогексилмочевины отфильтровали, фильтрат охладили до 0-5^oC и прибавили к нему 1,47 г (7 ммоль) гидрохлорида трет-бутилового эфира L-валина, 1,3 мл (9,5 ммоль) триэтиламина и перемешивали при охлаждении 1 ч, 24 ч при комнатной температуре. Растворитель упарили в вакууме, остаток растворили в хлористом метилене (200 мл) и промыли 5%-ным раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором NaHCO₃, сушили MgSO₄ и упарили в вакууме. Получили 1,9 г (80%) сырого гликопептида (IVз), который переосадили из ацетона гексаном. Выход защищенного гликопептида 1,2 г (48% ). Rf 0,48 (хлороформ-спирт, 7:1); [α]20D

+30^° (с 0,02; MeOH).

ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (OH, NH); 1740 (COOP); 1670 (C ₁₁=0); 1540 (CONH). УФ-спектр, λMeOHmax

, (lgε): 249 нм (3,99). Найдено, C 63,96; H 8,85; N 3,47. C₆₉H₁₁₆N₃O₁₉. Вычислено, C 63,16; X 9,04; N 3,25.

Деблокирование гликопептида (IVз).

1,0 г (0,8 ммоль) защищенного гликопептида в 20 мл CF₃COOH перемешивали при комнатной температуре 1 ч и упарили в вакууме. Остаток растерли сухим эфиром и сушили в вакууме при 40-45^oC 3 ч. Сухой остаток (0,84 г) хроматографировали на колонке с силикагелем L (40/100 мкм), элюируя смесью хлороформ-метанол-вода 100:10:1, 50:10:1, 25:10:1, 10:10:1. Смесью 50:10:1 вымывали 0,42 г (46,7%) гомогенного по ГСХ гликопептида (Пз) в виде аморфного вещества желтоватого цвета. Rf 0,5 (хлороформ метанол-вода 45:10:1), [α]20D

+45^° (с 0,02; εtOH).

Преимущества предлагаемого способа следующие.

1. В качестве аминокомпонентов (АК) в предлагаемом способе используются свободные аминокислоты и дипептиды, а не эфиры, как в способах [1] и [4] что упрощает и удешевляет процесс получения гликопептидов ГК (например, стоимость 1 г эфира аминокислоты дороже стоимости аминокислоты).

2. В качестве конечных продуктов образуются свободные гликопептиды общей формулы (II) (со свободными COOH-группами), т.е. отпадает необходимость проведения стадии деблокирования [5] что также упрощает процесс получения гликопептидов ГК.

3. В качестве основания в предлагаемом способе используется 1N раствор NaOH вместо третичного основания (триэтиламина) в известном способе [1, 4] что также значительно удешевляет процесс получения гликопептидов ГК.

Изобретение относится к органической химии, конкретно к способу получения тритерпеновых гликопептидов - производных глицирризиновой кислоты (ГК) с использованием незащищенного гликозида (карбокси-компонент) и свободных аминокислот или дипептидов (аминокомпонет АК). В предлагаемом способе глицирризиновую кислоту обрабатывают комплексом F в среде диметилформамида при 0^oC 1 ч, при комнатной температуре 4 ч, выдерживают в течение ночи при 4-80^oC и получают активированный трис-пентафторфениловый эфир ГК, который в растворе вводят в реакцию с аминокислотами или дипептидами в присутствии 1N раствора NaOH при соотношении реагентов ГК/комплекс F/АК, равном 1:3-3,5/3-4 ммоль. Выход целевых соединений 62,5-90,9%.

Способ получения тритерпеновых гликопептидов производных глицирризиновой кислоты общей формулы

где R L Ala, L Val, L Met, L Ile, L Glu, Gly L Phe
путем активации карбоксильных групп незащищенной глицирризиновой кислоты (ГК) активирующим комплексом через стадию конденсации с образованием активированного интермедиата в среде растворителя в присутствии основания с образованием гликопептидной связи в течение 24 ч, отличающийся тем, что гликозид подвергают взаимодействию с комплексом пентафторфенола N,N'-дициклогексилкарбодиимида в соотношении 3 1 (комплекс F) при 0 - 5^oС в течение 1 ч, при комнатной температуре в течение 4 ч с последующим выдерживанием при 4 8^oС в течение ночи и конденсацией активизированного интермедиата с аминокислотами (АК) формулы RNH₂,
где R CH₃CH (L Ala) (a);





в присутствии 1 н. раствора NaOH при ммолярном соотношении реагентов ГК комплекс F АК соответственно 1 3,0 3,5 3 4.