ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2000 года по МПК C12N7/04 A61K31/70 C07H21/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к вирусологии, медицине, а именно к применению алкилирующих производных фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов общей формулы

где В - остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина; RCl - остаток алкилирующего амина, например 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина

n = 12-30, в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Фосфотиоатные аналоги олигонуклеотидов (ФТАО) и их производные нашли широкое применение в качестве биологически активных соединений [1-8]. По своим свойствам ФТАО отличаются от природных олигонуклеотидов устойчивостью к действию клеточных нуклеаз, что способствует их длительной сохранности в клеточной среде и приводит к увеличению биологической активности таких препаратов.

Известно, что наиболее выраженным ингибирующим свойством среди известных производных ФТАО, испытанных на анти-ВИЧ активность, обладают холестероловые производные ФТАО [3-4]. Однако такие производные обладают недостаточно высокой активностью, поскольку блокирование репродукции вируса в данном случае происходит за счет связывания их с компонентами вирусных частиц, которое является обратимым.

В случае воздействия реакционноспособных производных ФТАО может происходить не только обратимое связывание реагента с компонентами вирусных частиц, но и необратимая модификация составных компонентов вируса, обеспечивающих различные этапы его размножения. Вследствие этого введение реакционноспособной группы в состав ФТАО может в значительной мере повысить эффективность ингибирования репродукции вируса. Однако, из-за высокой нуклеофильности фосфотиоатной группы не исключается самомодификация межнуклеотидных фосфотиоатных групп под воздействием реакционноспособной группировки, вводимой в состав ФТАО [9]. Как следствие, такая самомодификация может приводить к потере реакционной способности реагента. Проявление повышенного эффекта ингибирования репродукции вируса в этом случае не очевидно и может в существенной мере зависеть от нуклеофильности модифицируемых соединений и компонентов среды и их концентрации, а также от избирательности реакционноспособной химической группировки, вводимой в состав ФТАО.

Известны реакционноспособные алкилирующие производные ФТАО общей формулы (I), которые в присутствии нулеофильных соединений в среде способны их модифицировать [9-11]. Однако на сегодняшний день такие производные ФТАО на анти-ВИЧ активность не испытаны.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности ингибирования репродукции ВИЧ в ряду производных ФТАО и расширение ассортимента производных ФТАО, обладающих анти-ВИЧ активностью.

Поставленная задача решается применением описанных [10, 11] реакционноспособных алкилирующих производных ФТАО общей формулы (I) в качестве ингибиторов репродукции вируса иммунодефицита человека.

Данные производные получают исходя из полностью деблокированных фосфотиоатных олигонуклеотидов общей формулы (I), где RCl = -ОН, путем предварительной активации 3'-концевой фосфатной группы в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин - дипиридилдисульфид по описанному ранее методу [10, 11] .

Реакционноспособная RCl группа в используемых соединениях (I) представляет собой остаток ароматического азотистого иприта, который способен через образование промежуточного этилениммониевого катиона алкилировать различные нуклеофилы [9, 12].

В качестве контрольного соединения для оценки анти-ВИЧ эффекта было использовано холестероловое производное ФТАО, поскольку из литературных данных известно, что среди известных производных ФТАО холестероловые производные ФТАО проявляют наибольшую анти-ВИЧ активность [3-4].

Для проведения испытаний был синтезирован антисмысловой 12-звенный фосфотиоатный аналог олигонуклеотида структуры
GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCp (II), комплементарный области (+)-цепи ДНК ВИЧ-1 (нуклеотиды 7516-7527) [13]. На основе фосфотиоатного олигонуклеотида (II) по методу [10] были получены его холестероловое GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCpNH(CH₂)₂C(O)-Chol (III) и алкилирующее GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCp-RCl (IV) производные, модифицированные по 3'-концу и несущие в этом положении молекулы остаток холестерина или реакционноспособную алкилирующую RCl-группу. Была проведена сравнительная оценка эффективности ингибирования репродукции ВИЧ-инфекции этими соединениями (олигонуклеотидными производными (III) и (IV)).

Ингибирование репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4 в присутствии олигонуклеотидных препаратов (III) и (IV), конечная концентрация которых в культуральной среде составляет 10,0 - 0,01 мкМ, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Об ингибировании репродукции ВИЧ в клетках судят по снижению накопления вирусспецифического белка p24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток, определяемой методом исключения трипановым синим, на 4-е сутки культивирования по сравнению с контролем.

Полученные экспериментальные данные приведены в таблице и в виде графических иллюстраций на фиг. 1 и 2, из которых видно, что алкилирующее фосфотиоатное производное (IV), фрагмент которого несет реакционную RCl-алкилирующую группировку на 3'-конце, в концентрации 1 мкМ практически на 100% защищает клетки от гибели, тогда как защитный эффект холестеролового производного (III) того же олигонуклеотида GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCp в той же концентрации не превышает 40%. При этом дозовая концентрация препарата, необходимого для защиты клеток от гибели (PD₅₀) и для ингибирования репродукции вируса (ID₅₀) на 50%, для алкилирующего и холестеролового производного (IV) и (III) составляют 0.06 и 1.97 мкМ, и 0.14 и 3.4 мкМ соответственно. Т. е. алкилирующее производное (IV) по этим параметрам (PD₅₀ (12ps-Chol)/PD₅₀(12ps-RCl) = 1.97/0.06= 32.8; ID₅₀(12ps-Chol)/ID₅₀(12р8-RCl) = 3.4/0.14 = 24.3; ) более чем в 20 раз эффективнее, чем холестероловое производное (III).

Таким образом, впервые установлена способность алкилирующих производных ФТАО ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток, не известная ранее, причем эффективность ингибирования таким препаратом значительно выше эффективности холестеролового препарата, обладающего наибольшей среди известных производных ФТАО анти-ВИЧ активностью. Эффект обнаружен уже при длине цепи в 12 нуклеотидных звеньев. На основании общих закономерностей действия таких препаратов проявляемый эффект в ряду 13-30 должен быть по крайней мере не меньше, чем при длине цепи, равной 12 [3, 4].

Приведенные ниже конкретные примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность исследуемых препаратов оценивают на культуре перевиваемых Т лимфоцитов человека (линия МТ-4). Исследуемые соединения растворяют в питательной среде RPMI-1640 без добавок и в соответствующих разведениях вносят в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток. Посевная концентрация составляет 0,5•10⁶ клеток/мл. Клетки культивируют в 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar" (США) на ростовой питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, при 37^oC и 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. При оценке цитотоксичности олигонуклеотидных производных все они оказались нетоксичными даже в максимальной из исследованных концентраций 15 мкМ.

Пример 2. Изучение влияния алкилирующего и холестеролового производного фосфотиоатного аналога олигонуклеотида на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток.

Суспензию инфицированных ВИЧ-1 с множественностью заражения 0,2-0,5 клеток МТ-4 после 1 ч инкубации при 37^oC (адсорбция вируса) разводят до посевной концентрации 5•10⁵ кл/мл ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, и вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Затем в контрольные лунки (не менее трех) вносят по 20 мкл питательной среды RPMI-1640 без добавок, а в остальные лунки вносят по 20 мкл препарата производных олигонуклеотидов в питательной среде RPMI-1640 без добавок с концентрацией 100-0.1 мкМ до его соответствующих конечных концентраций в культуральной среде 10 - 0,01 мкМ (по три лунки на каждую концентрацию). В несколько пустых лунок (не менее трех) вносят для контроля по 200 мкл суспензии неинфицированных клеток МТ-4 с концентрацией 5•10⁵ кл/мл. Планшеты закрывают и инкубируют во влажной камере CO₂ - инкубатора с 5% углекислого газа при температуре (36-37)^oC в течение 4-х суток.

По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим и контролируют уровень вируспродукции иммуноферментным методом. Подготовку образцов для иммуноферментного анализа (ИФА) осуществляют, инактивируя ВИЧ-1 добавлением к пробе твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией при температуре (6±0.2)^oC в течение не менее 24 часов. Приготовленные таким образом пробы анализируют, как описано в [14]. Анти-ВИЧ активность препаратов оценивают по снижению накопления вирусспецифического белка p24, а также, исходя из степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции, подсчитывая долю жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим в камере Горяева.

Полученные экспериментальные данные приведены в таблице. На основании этих данных строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию соединений, на 50% снижающую накопление вирусспецифического белка p24 (ID₅₀). Кроме того, на основании рассчитанной согласно [13] степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции на 4-е сутки культивирования в присутствии препаратов в различных концентрациях строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию соединений, на 50% защищающую клетки от гибели (PD₅₀). Дозозависимые кривые и количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ-1 для производных ФТАО (III) и (IV) представлены на фиг. 1, 2 и в таблице.

Положительный эффект, заключающийся в высокой степени подавления размножения ВИЧ в культуре клеток холестероловым и алкилирующим производными (III) и (IV), выражен количественными показателями ингибирования: ID₅₀ = 3.4 и 0.14 мкМ (по снижению накопления p24) и PD₅₀ = 1.97 и 0.06 мкМ (по защите инфицированных клеток от гибели) соответственно.

Таким образом, на примере испытанных конкретных соединений показано, что алкилирующие производные ФТАО обладают способностью ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток, причем эффективность таких препаратов может значительно (более чем в 20 раз) превышать эффективность известных холестероловых производных ФТАО.

Следует отметить, что по предварительным оценкам количество одной дозы предлагаемого препарата, необходимого для полного подавления репродукции ВИЧ в организме человека и действующего в течение 4-х суток, составит 16 мг, а стоимость такой дозы в среднем приблизительно 15-75 $. Количество же и стоимость такой же дозы холестеролового препарата ФТАО, необходимого для полного подавления репродукции ВИЧ, при этом должна быть выше не менее чем в 20 раз. Это указывает на перспективность предлагаемого ингибитора репродукции ВИЧ для создания лекарственных средств, пригодных для терапии СПИДа.

Список литературы:
1. Agrawal S., Goodchild J., Civeira M., Sarin P.S., Zamecnik P.C. Phosphoroamidate, phosphorothioate and methilphosphonate analogs of oligodeoxynucleotide: inhibitors of human immunodeficiency virus. // Nucleosides & Nucleotides, 1988, v. 8, p. 819-823.

2. Agrawal S., Goodchild J., Civeira M.P., Thornton A.H., Sarin P.S. and Zamecnik P.C. Oligodeoxynucleoside phosphoramidates and phosphorothioates as inhibitors of human immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. v. 85. p. 7079-7083.

3. Stein C.A., Pal R., De Vico A.L., Hoke G., Mumbauer S., Kinstler O., Sarngadharan M. G. , Letsinger R.L. Mode of action of 5'-linked cholesteryl phosphorothioate oligodeoxynucleotides in inhibiting syncytia formation and infection by HIV-1 and HIV-2 in vitro // Biochemistry, 1991, v. 30, N 9, p. 2439-2444.

4. Letsinger R. L., Znang G., Sun D.K., Ikeuchi Т., Sarin P.S. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties, and activity as inhhibitors of replicatioon of human immunodeficiency virus in cell culture // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 6553-6556.

5. Temsamani J., Kubert M., Tang J., Padmapria A., Agraval S. Cellular uptake of oligodeoxynucleotide phosphorothioates and their analogs // Antisense research and development, 1994, v. 4, N 1, p. 35-42.

6. Cohen J.S. (ed): "Oligonucleotides: Antisense inhibitors of gene expression". Topic in Molecular and Structural Biology, v. 12, 1989, London: The Macmillan Press LTD.

7. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.L., Fedorova O.S. (1993) Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. CRC Press, Inc Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.

8. Stein C.A., Subasinghe C., Shinozuka K., Cohen J.S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligonucleotides // Nucleic Acids Res., 1988, v. 16, N 8, p. 3209-3221.

9. Амирханов Н.В., Зарытова В.Ф. Реакционноспособные производные фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов. II. Свойства производных фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов, содержащих ароматический остаток азотистого иприта. Биоорган. химия. - 1997, т. 23, N 7, с. 569-575.

10. Патент РФ N 94010679, 20.11.1996.

11. Амирханов Н.В., Зарытова В.Ф. Реакционноспособные производные фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов. I. Селективная активация концевых фосфатов и получение фосфамидных производных фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов. Биоорган. химия. - 1995, т. 21, N 5, с. 365-375.

12. Гимаутдинова О.И., Карпова Г.Г., Ломакина Т.С., Шелпаква Е.Л., Чемасова Л. Н., Гринева Н.И. Алкилирование ДНК в комплементарных комплексах с 4-(N-2-хлорэтил-N-метиламино)бензил- 5'-фосфамидами олигонуклеотидов. Биоорган. химия. - 1980, т. 6, N 1, с. 70 - 80.

13. Svinarchik P. P. , Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pokrovsky A.G., Vlassov V.V. Inhibition of HIV proliferation in MT-4 cells by antisense oligonucleotide conjugated to lipophilic groups. //Biochimie, 1993, v. 75, p. 49-54.

14. Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. Изучение анти-ВИЧ активности β- глицирризиновой кислоты. Вопросы вирусологии. - 1992, N 5-6, с. 235-238.

Предложено применение алкилирующих производных фосфотиоатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов в качестве ингибитора репродукции ВИЧ. Данные соединения отличаются наиболее высокой эффективностью в ряду испытанных производных фосфотиоатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов. Изобретение применяется для подавления репродукции ВИЧ типа 1. 2 ил., 1 табл.

Применение алкилирующих производных фосфотиоатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов общей формулы (I)

где B - остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
RCL - остаток алкилирующего амина, например 4-(N-метил-N-2-хроэтиламино)бензилметиламина

n = 12 - 30;
в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека.