СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК C12N15/11 A61K31/70 C07H21/02 

Изобретение относится к вирусологии, медицине, а именно к разработке новых противовирусных препаратов, способных ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Одним из подходов к решению проблемы эффективного ингибирования репродукции патогенных вирусов является использование антисмысловых олигонуклеотидов [1,2].

В литературе описан ряд антисмысловых олигонуклеотидов и их различных производных, эффективно блокирующих размножение ВИЧ в культуре клеток [3-5]. Известны способы ингибирования ВИЧ с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, имеющих в структуре не менее 15 нуклеотидов [6].

Однако природные немодифицированные олигонуклеотиды довольно плохо проникают в клетку и быстро гидролизуются клеточными нуклеазами. Более устойчивы к действию клеточных нуклеаз производные олигонуклеотидов, несущие на 5'-конце защитную группировку [7].

Анти-ВИЧ активность неприродных (фосфоротиоатных) олигонуклеотидов, характеризующихся высокой стабильностью в клетках, связана с блокированием стадии адсорбции вируса и де зависит от нуклеотидной последовательности олигонуклеотидов [4].

Авторами [7] была выбрана уникальная последовательность в структуре РНК ВИЧ и синтезирован антисмысловой 20-звенный олигонуклеотид структуры pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA, комплементарный области начала трансляции открытой рамки считывания на (+) - цепи ДНК ВИЧ-1 (нуклеотиды 7516-7535). Полученные различные его производные, модифицированные по 5'-концу, несущие в этом положении молекулы алифатические остатки различной длины либо остаток холестерина, проявляют высокую анти-ВИЧ активность в культуре клеток, причем наиболее эффективным ингибитором ВИЧ является холестериновое производное [7].

Способ ингибирования ВИЧ такими производными является наиболее близким аналогом предлагаемому способу (прототип) [7].

Необходимо отметить, что недостатком применения длинных олигонуклеотидов и их производных для ингибирования репродукции ВИЧ является то, что они образуют стабильные комплементарные комплексы с нуклеиновой кислотой (НК) - мишенью при достаточно высокой температуре 60-80^oC, а в клеточной системе (при 37^oC) такие олигонуклеотиды могут образовывать несовершенные комплементарные комплексы и тем самым снижать специфическое действие.

Таким образом, разработка подходов, позволяющих повышать эффективность специфического воздействия олигонуклеотидов и их производных на нуклеиновые кислоты в физиологических условиях, остается актуальной задачей.

Технической задачей изобретения является расширение спектра производных антисмысловых олигонуклеотидов, обладающих специфической анти-ВИЧ активностью.

Поставленная задача решается применением тандема производных коротких олигонуклеотидов как ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека на модели первично инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4.

Тандем модифицированных коротких олигонуклеотидов представляет собой сочетание олигонуклеотида-реагента и олигонуклеотидов-эффекторов, стабилизирующих комплекс олигонуклеотидной части реагента с мишенью. Используя олигонуклеотид-эффектор с определенной последовательностью, можно направить олигонуклеотид-реагент в один выбранный участок НК-мишени, комплементарный используемому тандему. Для того, чтобы такой набор олигонуклеотидов мог эффективно действовать на НК внутри клетки, необходимо повысить способность его компонентов проникать через клеточную мембрану, что может быть достигнуто введением в олигонуклеотиды остатков стероидов. Авторами [8] была продемонстрирована способность 5'-холестерил(Chs)-3'-феназиний(Phnl) содержащих эффекторов - октануклеотидов и 3'-эстрон(Est) содержащего алкилирующего производного тетрануклеотида (реагента) эффективно и сайт-специфично взаимодействовать с 20-звенным участком ДНК-мишени в системе in vitro даже при 37^oC. Это позволило предположить, что подобный тандем коротких производных олигонуклеотидов (8+4+8) может быть эффективен для воздействия на НК внутри клетки, так как все его компоненты сочетают в себе повышенную способность проникать в клетки и обладают высокой устойчивостью к действию нуклеаз.

Таким образом, учитывая вышеуказанные факты, и на основе уже испытанной структуры для ингибирования репродукции ВИЧ в культуре клеток было получено несколько тандемов коротких производных олигонуклеотидов, несущих гидрофобные (Chs и Est), полициклические (Phnl) и реакционноспособные группировки (алкилирующие (RCl) либо металлсвязывающие (Blm), представленные в конце описания.

Сущность изобретения заключается в том, что, используя олигонуклеотид-эффектор с определенной последовательностью, направляют олигонуклеотид-реагент в один выбранный участок НК-мишени, комплементарный используемому тандему.

Способ ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4 в присутствии препаратов описанных тандемов производных коротких олигонуклеотидов, конечная концентрация которых в культуральной среде составляет 5,0 - 0,1 мкМ, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Об ингибировании репродукции ВИЧ в клетках судят по снижению накопления суммарного вирусного антигена и вирусспецифического белка p24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток, определяемой методом исключения трипановым синим, на 4-e сутки культивирования по сравнению с контролем.

Полученные экспериментальные данные приведены в таблице, из которой видно, что четко выраженной ингибирующей способностью обладает тандем коротких олигонуклеотидов 5, все три фрагмента которого несут защитные и/или реакционные группировки как на 3'-, так и на 5'- концах. Ингибирующий эффект остальных исследованных олигонуклеотидов (и их комбинаций) не превышает 10-30%.

Таким образом, впервые установлена способность тандема производных коротких олигонуклеотидов ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток, не известная ранее.

Важно подчеркнуть, что подобные структуры - тандемы производных коротких олигонуклеотидов в отличие от многозвенных олигонуклеотидов (15 и более нуклеотидов в структуре молекулы), значительно дешевле и доступнее и, кроме того, способны образовывать только совершенные комплексы с НК-мишенью, что позволяет воздействовать на мишень высокоспецифично и более эффективно. Наличие защитных либо реакционных группировок как на 5'-, так и на 3'- концах коротких олигонуклеотидов делает их менее уязвимыми для клеточных нуклеаз, а значит, более стабильными в клеточной системе. В добавок к этому введенные модификации позволяют таким конструкциям легче проникать в клетку.

На фиг. 1 представлена цитотоксичность тандемов производных коротких олигонуклеотидов в концентрации 50 мкМ в культуре клеток МТ-4; на фиг. 2 - анти-ВИЧ активность тандема модифицированных по 3'- и 5'- концам коротких олигонуклеотидов.

-. - защита ВИЧ-инфицированных клеток от гибели в присутствии различных концентраций тандема;
-+- ингибирование накопления p24 в культуральной среде в присутствии различных концентраций тандема;
-*- 50%-ная контрольная прямая.

Пример 1. Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность исследуемых препаратов оценивают на культуре перевиваемых Т лимфоцитов человека (линия МТ-4). Исследуемые соединения растворяют в питательной среде RPMI-1640 без добавок и в соответствующих разведениях вносят в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток. Посевная концентрация составляет 0,5•10⁶ клеток/мл. Клетки культивируют в 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar" (США) на ростовой питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, при 37^oC и 5% CO₂ в течение 4 суток.

По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим.

При оценке цитотоксичности тандемов коротких олигонуклеотидов все они оказались нетоксичными даже в максимальной из исследованных концентраций 50 мкМ (фиг.1).

Пример 2. Изучение влияния тандема производных коротких олигонуклеотидов на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток.

Суспензию инфицированных ВИЧ-1 с множественностью заражения 0,2-0,5 клеток МТ-4 после 1 ч инкубации при 37^oC (адсорбция вируса) разводят до посевной концентрации 5•10⁵ кл/мл ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Затем в контрольные лунки (не менее трех) вносят по 20 мкл питательной среды RPMI-1640 без добавок, а в остальные лунки вносят по 20 мкл препарата тандема производных коротких олигонуклеотидов в питательной среде RРМI-1640 без добавок с концентрацией 50 - 1 мкМ до его соответствующих конечных концентраций в культуральной среде 5 - 0,1 мкМ (по три лунки на каждую концентрацию). В несколько пустых лунок (не менее трех) вносят для контроля по 200 мкл суспензии неинфицированных клеток МТ-4 с концентрацией 5•10⁵ кл/мл. Планшеты закрывают и инкубируют во влажной камере CO₂-инкубатора с 5% углекислого газа при температуре 36-37^oC в течение 4 суток.

По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим и контролируют уровень вируспродукции иммуноферментным методом. Подготовку образцов для ИФА осуществляют, инактивируя ВИЧ-1 добавлением к пробе твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией при температуре (6±2)^oC в течение не менее 24 часов. Приготовленные таким образом пробы анализируют, как описано в [9].

Анти-ВИЧ активность препаратов оценивают по снижению накопления суммарного вирусного антигена или вирусспецифического белка p24, а также исходя из степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции, подсчитывая долю жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим в камере Горяева.

Полученные экспериментальные данные приведены в таблице. На основании этих данных строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию соединений, на 50% снижающую накопление суммарного вирусного антигена или вирусспецифического белка p24 (ID₅₀). Кроме того, на основании рассчитанной согласно [7] степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции на 4-е сутки культивирования в присутствии препаратов в различных концентрациях строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию соединений, на 50% защищающую клетки от гибели (ID₅₀). Дозозависимые кривые и количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ-1 для тандема 4 - наиболее эффективного ингибитора ВИЧ представлены на фиг. 2.

Положительный эффект, заключающийся в высокой степени подавления размножения ВИЧ в культуре клеток тандемом коротких олигонуклеотидов 5, выражен количественными показателями ингибирования: ID₅₀ = 3,5 мкМ (по снижению накопления p24) и ID₅₀ = 1,65 мкМ (по защите инфицированных клеток от гибели).

Таким образом, показано, что тандемы производных коротких олигонуклеотидов обладают способностью ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток.

Полученные данные указывают на необходимость дальнейшего углубленного исследования комбинаций олигонуклеотидов с целью определения перспектив клинического использования таких препаратов для лечения вирусных инфекций.

Список литературы
1. Zamecnik P. C. , Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 280-284, 1978.

2. Wright J.A., Anazodo M. Antisense molecules and their potential for the treatment of cancer and AIDS. The cancer journal vol. 8, N 4, 185-189, 1995.

3. Agrawal S. , Goodchild J. , Civeira M., Sarin P.S., Zamecnik P.C. Phosphoroamidate, phosphorothioate and methilphosphonate analogs of oligodeoxynucleotide: inhibitors of human immunodeficiency virus. Nucleosides & Nucleotides vol. 8, p. 819-823, 1988.

4. Agrawal S., Goodchild J., Civeira M.P., Thornton A.H., Sarin P.S. and Zamecnik P.C. Oligodeoxynucleoside phosphoramidates and phosphorothioates as inhibitors of human immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 7079-7083.

6. Goodchild J., Zamecnik P. Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides. United States Patent N 4806463, C 12 Q 1/70, 1989.

7. Svinarchik F.P., Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pokrovsky A.G., Vlassov V. V. Inhibition of HIV proliferation in MT-4 cells by antisense oligonucleotide conjugated to lipophilic groups. Biochimie, v. 75, p. 49-54, 1993.

8. Д. В. Пышный, И.А. Пышная, С.Г. Лохов, Е.М. Иванова, В.Ф. Зарытова. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. I. Влияние различных типов эффекторов на алкилирование ДНК-мишеней. Биоорганическая химия, т. 21, N 9, с. 709-716, 1995.

9. О. А. Плясунова, И.Н. Егоричева, Н.В. Федюк, А.Г. Покровский, Л.А. Балтина, Ю. И. Муринов, Г. А. Толстиков. Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты. Вопросы вирусологии, N 5-6, с. 235-238, 1992.

Способ основан на использовании нескольких тандемов коротких производных антисмысловых олигодезоксинуклеотидов, несущих гидрофобные и реакционноспособные группировки, которые обладают ингибирующим эффектом на процесс репродукции ВИЧ первого типа. Способ может найти применение в вирусологии или медицине при разработке новых противовирусных препаратов. 2 ил., 1 табл.

Способ ингибирования репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 типа в первично инфицированных лимфоидных клетках, включающий внесение антисмыслового олигодезоксинуклеотида, отличающийся тем, что в качестве олигодезоксинуклеотида используют тандемы коротких олигонуклеотидов, несущих гидрофобные и реакционноспособные группировки.