СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3'-ФОСФАТ,N,P-НЕЗАЩИЩЕННЫХ ФОСФОТИОАТНЫХ АНАЛОГОВ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ Российский патент 1999 года по МПК C07H21/00 C07H21/04 

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к способу получений 3'-фосфат, N, P-незащищенных фосфотиоатных олигонуклеотидов (ФТАО) общей формулы I

где B - остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n = 1-20 (общепринятого, что к олигонуклеотидам относятся полинуклеотидные последовательности длиной цепи от 1 до примерно 20).

которые могут быть использованы в качестве исходных соединений для получения фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов [1-3] для биотехнологических целей [4-8].

Известен способ получения 3'-фосфат, N,P-незащищенных ФТАО общей формулы I путем последовательной обработки 5'-O-диметокситритил, 3'-pSMe,N-ацил, P(O)(SMe)-защищенных фосфотиоатных олигонуклеотидов общей формулы II

где B' - остаток тимина, N⁴-бензоилцитозина, N⁶-бензоиладенина, N²-изобутирилгуанина;
DMTr - 4,4'-диметокситритил;
n = 1-20,
раствором йода в водном пиридине в течение 20 мин для удаления 3'-p-концевых SMe-защит, затем раствором тиофенола в смеси триэтиламина и диоксана для удаления Me-групп с межнуклеотидных P(O)-SMe остатков (в результате которой образуются межнуклеотидные фосфотиоатные группы) с последующей обработкой водным аммиаком (для удаления N-ацильных защит с гетероциклических оснований нуклеотидов) и уксусной кислотой (для удаления 5'-O-диметокситритильных защитных групп) с выделением целевого продукта ионообменной хроматографией [2,3] (прототип). Недостатком данного способа является низкий выход целевых олигонуклеотидов из-за относительно высокой степени разрыва межнуклеотидных связей при обработке тиофенолом, которая составляет 15% на одну межнуклеотидную связь. В связи с этим выход целевого олигонуклеотида снижается с увеличением длины олигонуклеотидной цепи, который в случае ди-, три- и октануклеотидов составляет 85,71 и 15%, соответственно.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Поставленная задача достигается использованием в отличие от прототипа в качестве исходных соединений - известных [9] 5,-O-диметокситрил, 3'-p(S)SMe, N-ацил, P(S)(SMe)-защищенных фосфодитиоатных олигонуклеотидов общей формулы III

где B'-остаток тимина, N⁴-бензоилцитозина, NM⁶-бензоилладенина, N²-изобутирилгуанина;
DMTr - 4,4'-диметокситритил;
n = 1-20,
и обработкой исходных соединений раствором йода в течение 1-2 часов. При этом исключается стадия обработки промежуточной реакционной смеси раствором тиофенола.

По предлагаемому способу целевые 3'-фосфат, N,P-незащищенных ФТАО общей формулы I получают путем последовательной обработки известных 5'-диметокситритил, 3'-p(S)SMe, N-ацил, P(S)(SMe)-защищенных фосфодитиоатных олигонуклеотидов [9] общей формулы III раствором йода в водном пиридине в течение 1-2 часов для удаления 3'-p-концевых SMe-защит (при этом методом ³¹P-ЯМР-спектроскопии показано, что межнуклеотидные фосфодитиотриэфирные-OP(S)(SMe)O-группы сохраняются, а 3'- концевая p(S)(SMe)группа при этом полностью окисляется до фосфата), затем раствором водного аммиака для одновременного удаления SMe-группы с межнуклеотидных P(S)SMe остатков (в результате которой образуются межнуклеотидные фосфотиоатные группы) и N-ацильных защит с гетероциклических оснований нуклеотидов, с последующей обработкой уксусной кислотой (для удаления 5'-O-диметокситритильных защитных групп) с выделением целевого продукта ионообменной хроматографией. Выходы целевых ди-, три-, окта- и додекануклеотидов общей формулы I (n=1, 2, 7 и 11) в этом случае составляют 95, 88, 65 и 50%, соответственно. Таким образом, выходы целевых 3'-фосфат, N, P-незащищенных ФТАО I, получаемых по предлагаемому способу, существенно превышают выходы соответствующих соединений, получаемых известным способом, причем эта разница в выходах увеличивается с длиной синтезируемой олигонуклеотидной цепи, что связано с относительно низкой по сравнению с прототипом разрывом межнуклеотидных связей (в предлагаемом способе эта величина не превышает 5% на одну межнуклеотидную связь). К тому же в предлагаемом способе отсутствует стадия обработки промежуточной реакционной смеси раствором тиофенола.

Получение целевых 3'-фосфат, N,P-незащищенных ФТАО I предлагаемым способом было неочевидно, поскольку при обработке исходных соединений III, в отличие от соединений II, раствором йода в водном пиридине не исключается возможность окисления атома серы в межнуклеотидных -OP(S)(SMe)O-фосфодитиотриэфирных группах. В связи с этим специально была исследована процедура удаления SMe-защит предлагаемым способом. Методом ³¹P-ЯМР-спектроскопии было показано, что при обработке исходных соединений III раствором йода в водном пиридине в указанных выше условиях межнуклеотидные фосфодитиотриэфирные-OP(S)(SMe)O-группы не затрагиваются, а 3'-концевая p(S)(SMe)группа при этом окисляется до фосфата. Причем при обработке исходного соединения III раствором йода в условиях, приведенных в прототипе (20 мин), 3'-концевая p(S)(SMe) группа окисляется до фосфата лишь на 40%.

Пример 1. Синтез 3'-фосфат дитимидилил фосфотиоата,
TpsTp (IV).

а) 0.1 ммоль (114 мг) защищенного димитидилата DMTTrTp(S)(SMe)Tp(S)(SMe) IVа (соединение общей формулы III, где B'-тимидин, n=1), полученного по известной методике [9], растворяют в 10 мл смеси пиридин-вода (3:2), добавляют 129 мг йода (1 ммоль). Через 1.5 часа реакционную смесь упаривают, растворяют в 10 мл воды и избыток йода удаляют экстракцией эфиром (3 х 50 мл). Водные слои упаривают. Получают промежуточное соединение DMTTrTp(S)(SMe)Tp (IVб), которое анализируют ³¹-P-ЯМР-спектроскопией. В спектрах ³¹-P-ЯМР (пиридин-вода, 3:2) обнаружено:
1) сигналы в области 93-96 м.д., относящиеся к исходным межнуклеотидным фосфодитиотриэфирным SMe-фосфодитиоатным группам (-OP(S)(SMe)O-) [9];
2) полное исчезновение сигналов в области 72-74 м.д., относящихся к 3'-концевой p(S)(SMe) фосфотидитиодиэфирной группе (-OP(S)(SMe)O^-) [10];
3) появление сигналов в области 1.6 м.д., относящихся к деблокированной моноэфирной 3'-фосфатной группе (-OP(O)(O^-)O^- [11].

Эти данные свидетельствуют о селективном и количественном деблокировании SMe-защит в приведенных условиях только с 3'-концевой фосфатной группы и об образовании соединения (IVб).

Далее реакционную смесь, содержащую соединение (IVб), обрабатывают концентрированным аммиаком в течение 3-х суток при 60^oC, получают промежуточное соединение DMTrTpsTp (IVв), которое анализируют ³¹P-ЯМР-спектроскопией. Отсутствие в спектрах сигналов в области 93-96 м.д. и появление сигналов в области 55,7 м.д., на основании литературных данных [2,3,11], свидетельствует о полном деблокировании SMe-групп P(S)SMe фосфодитиотриэфирных межнуклеотидных остатков (-OP(S)(SMe)O-) в промежуточном соединении (IVб) и об образовании диэфирных фосфотиоатных межнуклеотидных групп (-OP(S)(O^-)O-=ps). Эти данные подтверждают структуру полученного промежуточного соединения (IVв).

Далее реакционную смесь, содержащую промежуточное соединение (IVв), выдерживают в 10 мл 80% уксусной кислоты в течение 30 мин и упаривают на ротационном испарителе (для удаления DMTr-защитных групп), получают соединение (IV). Соединение (IV) выделяют хроматографией на колонке с ионообменным носителем (Полисил CA) в градиенте KH₂PO₄, содержащем 20% ацетонитрил. Целевой продукт обессоливают на обращенно фазовой колонке, элюируя продукт 50% водным ацетонитрилом и упаривают.

Получено 0.095 ммоль (1605 OE₂₆₀) целевого соединения ε₂₆₀ = 16.8 • 10³ л•моль^-1. см^-1. Выход 95%.

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим физико-химическим характеристикам (ионообменная и обращенно фазовая хроматография, УФ- и ЯМР-спектроскопия) идентичен соединению (IV), полученному по способу [2].

б) Синтез ведут аналогично описанному в примере 1а, при этом обработку раствором йода ведут в течение 1 часа.

Получено 0.091 ммоль (1522 OE₂₆₀) целевого соединения (IV). Выход 91%.

в) Синтез ведут аналогично описанному в примере 1а, при этом обработку раствором йода ведут в течение 2 часов.

Получено 0.095 ммоль (1596 OE₂₆₀) целевого соединения (IV). Выход 95%.

г) синтез в условиях, приведенных в прототипе [2]
Обработка 0.1 ммоль защищенного дитимидилата DMTrTp(S)(SMe)Tp(S)(SMe) (IVа) раствором йода (в течение 20 мин), аммиака, уксусной кислотой и выделение продукта хроматографией в условиях примера 1а дает 0.032 ммоль (540 OE₂₆₀) соединения (IV). Выход 32%.

Анализ промежуточной реакционной смеси (по данным ³¹P-ЯМР-спектроскопии), содержащей продукт (IVб), показывает на исчезновение сигналов в области 72-74 м. д. , относящихся к 3'-концевой p(S)(SMe) фосфодитиодиэфирной группе (-OP(S)(SMe)O^-) [10], и появление сигналов в области 1.6 м.д., относящихся к деблокированной моноэфирной 3'-фосфатной группе (OP(O)(O^-)O^- [11]. Если принять за 100% сумму площадей сигналов в области 72-74 и 1.6 м.д., то площадь сигналов в области 1.6 м.д. составляет 40%.

Эти данные свидетельствуют о том, что деблокирование SMe-защит с 3'-концевой фосфатной группы в соединении (IVа) при обработке раствором йода в течение 20 мин проходит лишь на 40%.

Пример 2. Синтез 3'-фосфат тритимидилил фосфотиоата
TpsTpsTp (V).

Обработка 159 мг (0,1 ммоль) защищенного тритимидилата DMTrTp(S)(SMe)Tp(S)(SMe)Tp(S)(SMe) (Vа) раствором йода, концентрированным аммиаком, уксусной кислотой и выделение продукта хроматографией в условиях примера 1а дает 0.088 ммоль (2186 OE₂₆₀) соединения (V) ε₂₆₀ = 24.9 • 10³ л•моль^-1 • см^-1. Выход 88%.

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим физико-химическим характеристикам (ионообменная и обращенно фазовая хроматография, УФ- и ЯМР-спектроскопия) идентичен соединению (V), полученному по способу [2].

Пример 3. Синтез 3'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиоата CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp (VI).

Обработка 41,4 мг (0,01 ммоль) защищенного октануклеотид фосфодитиоата DMTrC^bzp(S)(SMe)A^bzp(S)(SMe)Tp(S)(SMe) Tp(S)(SMe)G^ibp(S)(SMe)Tp(S)(SMe)G^ibp(S)(SMe)A^bzp(S)(SMe) (VIа) раствором йода, концентрированным аммиаком, уксусной кислотой и выделение продукта хроматографией в условиях примера 1а, дает 0.0065 ммоль (519 OE₂₆₀) соединения (VI) ε₂₆₀ = 79.5 • 10³ л•моль^-1 • см^-1. Выход 65%.

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим физико-химическим характеристикам (ионообменная и обращенно фазовая хроматография, УФ- и ЯМР-спектроскопия) идентичен соединению (VI), полученному по способу [2].

Пример 4. Синтез 3'-фосфат дезоксидодекануклеотид фосфотиоата.

GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsСpsApsGpsCp (VII).

Обработка 58 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли защищенного дезоксидодекануклеотид фосфодитиоата DMTrG^ibp(S)(SMe)C^bzp(S)(SMe)A^bzp(S)(SMe) Tp(S)(SMe)C^bzp(S)(SMe)A^bzp(S)(SMe)A^bzp(S)(SMe) G^ibp(S)(SMe)C^bzp(S)(SMe)A^bzp(S)(SMe)G^ibp (S)(SMe)C^bzp(S)(SMe) (VIIа) раствором йода, концентрированным аммиаком, уксусной кислотой и выделение продукта хроматографией в условиях примера 1а дает 0.005 ммоля (586 OE₂₆₀) соединения (VII). Выход 50%.

Продукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет большее время удерживания по сравнению с контрольным дезоксидодекануклеотидом GpCpApTpCpApApGpCpApGpCp, не содержащим межнуклеотидные фосфотиоатные группы. При обращенно фазовой хроматографии полученный продукт (VII) элюируется в виде смеси диастереомеров, время удержания которых больше, чем время удержания контрольного дезоксидодекануклеотида GpCpApTpCpApApGpCpApGpCp. УФ-спектры полученного соединения (VII) в воде: λ_min = 234 нм, λ_max = 268 нм, ε₂₆₀ = 117.3 • 10³ л•моль^-1 • см^-1 - идентичны со спектрами контрольного дезоксидодекануклеотида GpCpApTpCpApApGpCpApGpCp. B³¹P-ЯМР-спектрах (30% CH₃CN в H₂O) обнаруживаются сигналы, соответствующие сигналам межнуклеотидных фосфотиоатных групп (ps) (δ =55,2 - 56.2 м.д.) и 3'-концевому фосфату (δ = -0,2 м.д.) в соотношении 10,7 : 1 (теоретически 11:1).

Сумма представленных данных подтверждает структуру полученного соединения (VII)
ф

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к способу получения 3'-фосфат, N,P- незащищенных фосфотиоатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов общей формулы I, где В - остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина; n = 1 - 20, которые могут быть использованы в качестве исходных соединений для получения фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов для биотехнологических целей. Способ заключается в последовательной обработке исходных защищенных олигонуклеотидов раствором йода в водном пиридине, а затем водным аммиаком и уксусной кислотой, отличающийся тем, что в качестве исходных защищенных олигонуклеотидов используют 5'-O-диметокситритил, 3'-Р (S)SMe, N-ацил, P(S)(SMe)-защищенные фосфодитиоатные олигонуклеотиды общей формулы III, где B' - остаток тимина, N⁴-бензоилцитозина, N⁶-бензоиладенина, N²-изобутирилгуанина; DMTr - 4,4'-диметокситритил; n = 1-20, а обработку раствором йода ведут в течение 1-2 ч. Технический результат - увеличение выхода целевого продукта и упрощение процесса.

Способ получения 3'-фосфат,N,P-незащищенных фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов общей формулы I

где B - остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n = 1 - 20,
путем последовательной обработки исходных защищенных олигонуклеотидов раствором йода в водном пиридине, а затем водным аммиаком и уксусной кислотой, отличающийся тем, что в качестве исходных защищенных олигонуклеотидов используют 5'-O-диметокситритил, 3'-Р(S)SMe, N-ацил, P(S)SMe-защищенные фосфодитиоатные олигонуклеотиды общей формулы III

где B' - остаток тимина, N⁴-бензоилцитозина, N⁶-бензоиладенина, N²-изобутирилгуанина;
DMTr - 4,4'-диметокситритил;
n = 1 - 20,
а обработку раствором йода ведут в течение 1 - 2 ч.