СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА Российский патент 2000 года по МПК A61K39/00 A61K41/00 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской радиологии, в частности к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики радиационных поражений организма.

Известен способ профилактики радиационных поражений организма путем двухкратного облучения животных гамма-лучами в сублетальной (100 P) и летальной (900 P) дозах с интервалом между облучениями в 60 дней (см. А.с. N 212167, МКЛ A 61 K 3/14, 1988).

Недостатком способа является невозможность экстренной и групповой защиты большого поголовья животных, а также большие экономические затраты на источник излучения и использование для этой цели мощной стационарной облучательной техники.

Наиболее близким по технологической сущности является применение специфической профилактики радиационных поражений организма путем подкожного применения глобулина людей-доноров или лошадей в дозе 100 мг/кг за 1 час до летального облучения (см. кн. "Иммунотерапия экспериментальной острой лучевой болезни". Под ред. Н.Н.Клемпарской. - М.: Энергоиздат, 1991, с. 18-19).

Недостатком этого способа является низкая противолучевая эффективность препарата (выживаемость белых мышей повысилась только на 20-40%), непродолжительность радиозащитного действия, использование дефицитных реактивов при выделении и очистке глобулинов.

Известен также метод получения противолучевой кроличьей сыворотки для профилактики и лечения острой лучевой болезни, которую получают от кроликов путем локального облучения области печени животных рентгеновскими лучами в дозе 2000 P, убоя спустя 10-17 суток после облучения, получения сыворотки и введения ее с профилактической целью за 2 часа до облучения, что обеспечивает выживаемость 38-51% облученных животных (см. кн. "Иммунотерапия экспериментальной острой лучевой болезни". М.: Энергоиздат, 1981, с. 38-39). Недостатком его являются низкая лечебно-профилактическая эффективность препарата, ограниченность срока применения (через 50-60 минут) после облучения и использование высокой мощности (144 P/мин) и дозы рентгеновского облучения (2000 P) донора с применением открытой рентгенустановки, опасной для обслуживающего персонала.

Задачей изобретения является повышение противолучевой эффективности препарата для специфической профилактики радиационных поражений организма, увеличение срока радиозащитного действия (пролонгирование), упрощение и удешевление способа, повышение производительности.

Поставленная задача решается тем, что способ специфической профилактики радиационных поражений организма предусматривает введение в организм антигенсодержащего биологического препарата - специфического антигенного комплекса ткани облученных животных (АКТОЖ), который вводят млекопитающим однократно в дозах 45-50 мг на 1 кг живой массы подкожно за 15-30 суток до облучения.

Препарат для специфической профилактики радиационных поражений организма получают от облученных доноров (белых крыс, морских свинок, кроликов), облучение которых осуществляют гамма-лучами в летальной дозе (9,0-10,0 Гр), на 5-7 сутки после радиационного воздействия животных убивают, затем извлекают селезенку, которую после промывки и измельчения гомогенизируют в присутствии экстрагента (физиологического раствора), имеющего pH 8,6-8,9, и центрифугируют гомогенат при 12-13 тыс. об/мин в течение 15-20 мин, супернатант декантируют и доводят в нем содержание белка до 75-100 мг/мл.

Антигенный материал готовят из ткани селезенки, которую промывают в физиологическом растворе, измельчают ножницами, гомогенизируют в присутствии физиологического раствора с pH 8,6-8,9, которую коррегируют с помощью 1N раствора NaOH, полученный гомогенат центрифугируют при 12-13 тыс. об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант (насадочную жидкость) декантируют в стерильные стеклянные флаконы и подвергают стерилизующей фильтрации, затем проверяют на чистоту и стерильность общепринятым методом (см. кн. "Руководство по вакцинному и сывороточному делу". Под ред. П.П. Бургасова. - М.: Медицина, 1978, 439 с.), после проверки на чистоту и стерильность супернатанты объединяют в одну стерильную емкость и определяют содержание белка биуретовым методом (см. кн. "Экспериментальная иммунология". Под ред. П.Н.Холчева.- М.: Медицина, 1968, 665 с.) и доводят путем разведения в фосфатно-буферном растворе (pH 7,2-7,4) до оптимальной концентрации - 75-100 мг белка в 1 мл.

Фасуют готовый антигенсодержащий препарат (иммуноген-вакцину) в условиях бокса в стерильные стеклянные флаконы емкостью 100 мл, закрывают резиновыми пробками, заливают сургучом и этикетируют. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и иммунологическую активность осуществляют по общепринятой методике (см. вышецитированный источник). Срок годности иммуногена (вакцины) при условии хранения 2-6^oC до 1 года.

Способ специфической профилактики организма и способ получения препарата для его осуществления иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Для получения антигенного материала с оптимальной иммуногенной активностью использовали 5 групп белых крыс по 6 особей в группе и подвергали их гамма-облучению в дозах 4,0 Гр (1-ая группа), 6,0 Гр (2-ая группа), 8,0 Гр (3-я группа) и 10,0 Гр (4-я группа). Пятую группу крыс не облучали и они служили биологическим контролем. Через 3, 5, 7, 10, 14 суток после облучения животных убивали, извлекали селезенку, очищали ее от жировой и соединительной ткани. Очищенную таким образом ткань селезенки промывали 0,9-0,95%-ным раствором хлорида натрия, измельчали ножницами, заливали равным объемом того же раствора хлорида натрия с pH 7,4; 8,0; 8,4; 8,6; 8,9 и гомогенизировали в ротационном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком при 10, 11, 12, 13, 14 тыс. об/мин в течение 1, 3, 5, 10, 15 мин порциями объемом 5 мл. После этого гомогенат сливали в общую емкость, фильтровали через марлевый фильтр (8-10 слоев марли), затем материал центрифугировали при 6000, 8000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000 об/мин в течение 10, 15, 20, 25 минут. В полученных супернатантах определяли содержание белка биуретовым методом и содержание лучевых (радиоиндуцированных специфичных) антигенов в реакции преципитации (РП) (см. кн. "Экспериментальная иммунохимия". - М.: Медицина, 1968, с. 29-99), в которой в качестве источника антител использовали гипериммунную противолучевую сыворотку.

Результаты опытов показали, что наибольший выход антигенного материал (35-45 мг антигенного белка на 1 г ткани облученном селезенки) с наибольшей антигенной (серологической) активностью (титры антигена в РП - 1:64-1:128) получали при гамма-облучении белых крыс в дозе 7,0-8,0 Гр, убое животных через 5-7 суток после облучения, экстрагировании в растворе NaCl с pH 8,6-8,9 в гомогенизаторе в течение 5-10 мин и центрифугировании при 12-13 тыс. об/мин в течение 15-20 мин. Любые изменения перечисленных оптимальных параметров получения антигенного материала (снижение или увеличение дозы облучения, pH экстрагента, времени и скорости гомогенизации и центрифугирования вели к снижению выхода антигенного материала и его серологической активности (содержание антигенного белка не более 15-20 мг/г и титры антигена не более 1:8-1:16).

Пример 2. В опытах на белых крысах устанавливали оптимальную дозу антигенного комплекса, используя для этой цели 90 самок белых крыс с живой массой 150-180 г, разделенных на 8 групп. Животных первых 6 групп после введения им подкожно различных доз антигенного материала (начиная с 10 мг/кг до 250 мг/кг) через 30 суток подвергали гамма-облучению в дозах, вызывающих абсолютный летальный эффект - гибель всех животных (ЛД₁₀₀-9,0 Гр). Опыты сопровождали соответствующими контролями: контроль облучения (без применения защитного комплекса), контроль облучения с введением антигенов тканей необлученных (интактных) доноров (контроль специфичности антигена). Оценку радиоустойчивости животных проводили по критерию выживаемости в течение 30 суток после радиационного воздействия.

Результаты титрации дозы (определение оптимального количества вводимого антигенного материала, обеспечивающего максимальный защитный эффект) представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что оптимальной дозой вводимого тканевого антигена облученных животных стало 50 мг/кг живой массы, которая обеспечивала выживаемость 80% животных, облученных в абсолютно смертельной дозе гамма-излучения.

Пример 3. Опыты по изучению радиозащитных свойств известного и предлагаемого способов проводили на 130 белых мышах живой массой 18-20 г, которым за 5, 10, 15, 20, 25, 30 дней до летального облучения (8,5 Гр) вводили предлагаемый радиозащитный препарат в дозе 50 мг/кг (1-ая группа), животным 2-й группы в те же сроки - известный препарат в дозе 250 мг/кг, а животным 3-й группы до облучения в той же дозе препарат не вводили (контроль облучения). За животными вели наблюдение в течение 30 дней после облучения, учитывая динамику гибели в каждой подгруппе. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, предлагаемый способ обеспечивал выживаемость 75-85% животных, облученных после введения им антигенсодержащего биологического препарата за 15 и 30 суток до летального и сублетального облучения, в то время как при применении известного метода процент выживаемости в эти сроки не превышал 5-15%, а продолжительность радиозащитного действия препарата 5-10 дней.

Пример 3. Противолучевую эффективность специфического антигена проверяли на 80 морских свинках, облученных в летальных (ЛД₁₀₀=6,0 Гр) и сублетальных (ЛД₅₀=3,0 Гр) дозах. Для сравнения параллельно проводили опыты по известному способу. Данные исследований по известному и предлагаемому способам приведены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что по известному способу противорадиационный эффект (55-57%) наступал только через 60 дней после повторного облучения животных гамма-лучами. В отличие от известного результаты иммунизации животных перед облучением предлагаемым антигенным комплексом подтвердили 85-90%-ную выживаемость животных, облученных в летальных и сублетальных дозах за 15-30 дней после введения антигена.

Таким образом, предлагаемый способ специфической профилактики радиационных поражений организма обеспечивает выживаемость 80-90% облученных животных, что на 25-30% выше, чем при применении известного метода, технически прост в исполнении, позволяет проводить экстренную и групповую обработку (иммунизацию) большого поголовья животных, увеличивает продолжительность радиозащитного действия до 30 суток вместо 1 часа по известному. Кроме того, предлагаемый способ специфической профилактики радиационных поражений организма может найти применение не только в ветеринарии, но и в медицине.

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской радиобиологии, в частности к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики радиационных поражений организма. Способ специфической профилактики радиационных поражений организма заключается в однократном подкожном введении в организм антигеносодержащего биологического препарата - специфического антигенного комплекса тканей облученных животных в дозах 45/50 мг на 1 кг живой массы за 15-30 сут до облучения. Препарат для специфической профилактики радиационных поражений организма получают от гамма-облученных в летальных дозах доноров (белых крыс, морских свинок, кроликов), которых на 5-7 сутки после облучения убивают, извлекают селезенку, гомогенизируют, центрифугируют при 12-13 тыс. об/мин, супернатант декантируют, доводят в нем содержание белка до 75-100 мг/мл и используют по назначению. Изобретение обеспечивает повышение противолучевой эффективности препарата для специфической профилактики радиационных поражений организма, повышение срока радиозащитного действия, упрощение и удешевление способа, повышение производительности. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ специфической профилактики радиационных поражений организма, предусматривающий введение в организм антигеносодержащего биологического препарата, отличающийся тем, что в качестве антигеносодержащего биологического препарата используют специфический антигенный комплекс тканей облученных животных, который вводят однократно подкожно в дозах 45 - 50 мг на 1 кг живой массы за 15 - 30 сут. до облучения. 2. Способ получения препарата для специфической профилактики радиационных поражений организма, включающий облучение животного-донора (белых крыс, морских свинок, кроликов) ионизирующими излучениями, отличающийся тем, что гамма-облучение доноров осуществляют в летальной дозе (9 - 10 Гр), а на 5 - 7 сут. после облучения производят убой, извлекают селезенку, которую после промывки и измельчения гомогенизируют в присутствии экстрагента (физиологического раствора), имеющего pH 8,6 - 8,9, гомогенат центрифугируют при 12 - 13 тыс.об/мин в течение 15 - 20 мин, супернатант декантируют, содержание белка доводят до 75 - 100 мг/мл.