СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА Российский патент 2005 года по МПК A61K39/35 G01N33/531 

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности к получению и применению препаратов, предназначенных для диагностики радиационных поражений организма.

Известно, что среди явлений, развивающихся после действия ионизирующей радиации, значительную роль играют аллергические реакции, обуславливая развитие в облученном организме одного из основных симптомов радиационного поражения - радиосенсибилизации. Следовательно, своевременное выявление лучевой аллергии (радиосенсибилизации) является залогом успешного лечения лучевой болезни. Поэтому разработка эффективных методов и средств выявления лучевой аллергии представляет актуальную проблему ветеринарии и медицины. Одним из общепринятых методов выявления аллергического состояния служит внутрикожное введение соответствующего аллергена для получения местной гиперергической реакции. Однако, несмотря на перспективность этого метода, аллергическая диагностика лучевых поражений до сих пор не разработана, поскольку ветеринарная и медицинская практика не располагают специфическим аллергенным препаратом.

Известен способ выявления состояния аутосенсибилизации облученного организма путем интралабиального введения белым мышам в качестве аллергенов стерильного молока, стерильной лошадиной сыворотки, взвеси суточной агаровой культуры кишечной палочки, а также экстрактов гомологичных тканей интактных и облученных животных - тонкого кишечника, печени, селезенки, костного мозга, и оценки реакции по 4-х балльной системе (см. Клемпарская Н.Н. и др. Локальные пробы как метод для выявления состояния аутосенсибилизации облученного организма. - Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1958. -№12. -С.28-32).

Недостатком метода является весьма высокая болезненность внутригубной (интралабиальной) пробы для животных, выполнение которого на крупных животных является проблематичным, а оценка результатов лабиальной реакции является субъективной, не поддающаяся инструментальному измерению. Использованные для выполнения указанного метода выявления лучевой сенсибилизации аллергены являются неспецифичными, ибо многие из них не являются истинными аллергенами.

Наиболее близкими к естественным аллергенам из испытанных средств являются экстракты из гомологичных тканей интактных и облученных животных - тонкого кишечника, селезенки и костного мозга (см. там же, стр.30). Однако установлено, что из указанных антигенов только экстракты тонкого кишечника выявляли состояния аутосенсибилизации у облученных мышей к веществам тканей того же вида (гомосенсибилизация), но этот антиген не может быть использован в качестве лучевого аллергена, поскольку, во-первых, для выявления лучевой сенсибилизации согласно этому методу необходимо применять гомологичные аллергены для каждого вида, т.е. для белых мышей экстракт кишечника мышей, для крыс - экстракт кишечника крыс, для морских свинок - экстракт кишечника морских свинок и т.д., что представляет собой технически невыполнимую задачу, ибо требуется готовить столько видов аллергенов, сколько существует видов животных и, во-вторых, тканевые экстракты, являясь полноценными белковыми антигенами, при введении в организм индуцируют образование противоорганных, противотканевых антител, что является нарушением одного из требований, предъявляемых к аллергенам - они при введении в организм не должны образовывать антитела к данному препарату. Следовательно, тканевые антигены (экстракты из органов) не отвечают к главному требованию аллергологии - аллергены не должны обладать антигенностью, и поэтому не могут быть использованы в качестве аллергенов при той или иной патологии.

Задачей изобретения является получение специфического лучевого антигена для выявления состояния радиосенсибилизации организма и принятия экстренных мер по десенсибилизирующей терапии лучевой болезни.

Поставленная задача решается тем, что способ получения препарата для диагностики радиационных поражений организма, включающий извлечение из облученных объектов аллергенного материала, в качестве аллергена используют хроматографически чистую фракцию хиноидного радиотоксина, выделенного из этанолового экстракта облученного в дозе 350-400 Гр клубней картофеля, который вводят животным внутрикожно в область внутренней поверхности бедра (мелкий рогатый скот), с наружной стороны основания уха (у свиньи), верхней трети шеи (крупный рогатый скот, лошади) в количестве 0,1-0,2 см³ (1,5-2 мкг на животное) и по индексу аллергии (ИА), равному или превышающему 1,12 (ИА больше или равно 1,12), ставят диагноз на лучевую болезнь.

Существенным отличием способа получения препарата для аллергической диагностики радиационных поражений организма является то, что в качестве специфического аллергена используют основной этиопатогенетический фактор радиационного поражения - естественный радиомиметик - радиотоксин, ответственный за развитие в облученном организме радиосенсибилизирующего эффекта. В результате облучения в летальной дозе из поврежденных клеток продукты радиолиза тканей поступают в кровь и лимфу, которые осуществляют аутоиммунизацию организма, приводят к постепенному формированию в нем процесса анафилактоидного типа, характеризующегося как повышенная чувствительность замедленного типа к радиоиндуцированным токсическим продуктам, т.е. развивается аутоаллергия. При внутрикожном введении токсического компонента - радиотоксина облученному животному развивается ответная реакция организма в виде гиперергической аллергической кожной реакции с различной интенсивностью, демонстрируя (выявляя) факт радиосенсибилизации у исследуемого животного.

Использование в качестве аллергена в интрадермальной пробе естественного радиомиметика - растительного радиотоксина - позволяет унифицировать диагностический препарат и значительно повысить его специфичность, поскольку, во-первых, он свободен от общетканевых (общегрупповых) антигенов, содержащихся в тканевых экстрактах, и, во-вторых, препарат не обладает антигенностью, поскольку в нем содержание белка минимальное (1,5-1,8%) и, в основном, он содержит низкомолекулярный гликопептид - продукт комплексирования хиноидной "простетической" группы с остатками аминокислот и пептида.

Использование полученного аллергена в интрадермальной пробе позволяет в начальные сроки после облучения (первые 5-6 суток) выявить развитие в организме состояние радиосенсибилизации и провести экстренную десенсибилизацию организма, предотвращая тем самым радиационную гибель животных.

Способ получения аллергического препарата осуществляют следующим образом.

Клубни картофеля подвергают однократному внешнему гамма облучению в дозе 350-400 Гр при мощности экспозиционной дозы 250 Гр/ч. Облученные клубни выдерживают при температуре 18-22°С в течение 24 ч. Дальнейшую обработку облученного объекта с целью изолирования аллергенного материала - хиноидного радиотоксина - проводят по общепринятой методике (см. кн. Радиотоксины, их природа и роль. Под ред. А.М.Кузина М.: Атомиздат, 1966. - С.86-91). Для этого с клубней картофеля снимают верхний слой толщиной 3-4 мм и оставшуюся ткань гомогенизируют в трехкратном объеме 96%-ного этанола. Экстрагирование проводят в течение 1-1,5 ч при постоянном перемешивании, строму отделяют центрифугированием и спирт удаляют под вакуумом при температуре 28-33°С. Осадок, который образуется в результате концентрирования, отделяют, а прозрачный слегка желтоватый раствор подкисляют соляной кислотой до рН 7,2 и экстрагируют этилацетатом. Полученный этилацетатный слой наносят на бумажную хроматограмму (20×20 см) и разгоняют в двух растворителях: 2%-ной уксусной кислоте и в смеси бензол - уксусная кислота - вода (2:4:1). Полученные хроматограммы подвергают инфракрасной спектрофотометрии по общепринятой методике (Копылов В.А. Механизм образования и идентификации токсических веществ хиноидной природы, образующихся в облученном организме. М.: Атомиздат, 1966. - С.18-28). Фракции, флуоресцирующие синим цветом, переходящим затем в ярко-голубой цвет, элюируют 2%-ным раствором уксусной кислоты, объединяют в общую фракцию, нейтрализуют до рН 7,2. В полученном элюате определяют белок по Лоури, хиноны - по А.М.Кузину и В.А.Копылову (Радиотоксины. М.: Наука, 1983. - С.27-28), содержание сухого вещества - общепринятым методом высушивания до постоянного веса, биологическую активность - в тесте 50%-ного гемолиза эритроцитов по методу кислотных эритрограмм (И.А.Терсков, И.А.Гительзон. - Биофизика, 1957. - №2. - С.259).

Полученный по вышеописанной методике радиотоксин высушивают до постоянного веса и стандартизируют путем разведения его дистиллированной водой с рН 7,2 до концентрации 1,0 мг/мл, хранят при температуре 2-6°С и используют по целевому назначению - в качестве специфического лучевого аллергена во внутрикожной реакции для выявления радиосенсибилизированных животных.

Выявление состояния радиосенсибилизации у облученных животных осуществляют следующим образом. У морских свинок на боковой поверхности спины, у крупного рогатого скота и лошадей в области верхней трети шеи выстригают шерсть на площади размером 3×3 см³, у других видов животных шерсть (мелкий рогатый скот и свиней) не выстригают, аллерген вводят в область внутренней поверхности бедра (у овец, коз), в наружной стороне у основания уха (у свиней).

Аллерген вводят строго внутрикожно в объеме 0,1-0,2 см³ (1,5-2,0 мкг на животное) в вышеуказанные области соответствующих видов животных. Читку реакции проводят через 24, 48, 72, 96, 120, 144 ч после облучения, регистрируя характер реакции на аллерген и оценку реакции проводят по 4-балльной системе: 1 балл - небольшая гиперемия на месте введения, 2 балла - яркая гиперемия, отек, 3 балла - гиперемия, отек, геморрагии, 4 балла - геморрагии, некроз. При обработке результатов вычисляют средний балл (индекс аллергии - ИА). Устанавливают, что у животных (необлученных животных) средний балл (индекс аллергии) колеблется в пределах от 0,3 до 1,0, а у облученных - от 1,12 и выше (ИА>1,12). Следовательно, диагностический индекс аллергии, равный или превышающий значение 1,12, свидетельствует о поражении организма ионизирующими излучениями, причем степень поражения коррелирует с индексом аллергии (ИА): для острой лучевой болезни легкой степени этот индекс колеблется в пределах от 1,12 до 2,0; для средней степени - от 2,1 до 3,1 и для тяжелой степени - от 3,1 и выше.

Регистрация результатов аллергических исследований в динамике показывает, что первичные реакции на аллерген у облученных животных начинают проявляться через 48-72 ч после облучения и достигают максимума на 4-6-е сутки. При введении аллергена на 5-е сутки после облучения реакция на аллерген появляется через 24 ч (на 6-е сутки), при введении аллергена на 10-е сутки после облучения реакция появляется в тот же день (через 4-6 ч), при введении аллергена на 15-е сутки - реакция на аллерген проявляется через 24-48 ч и в менее выраженной форме, т.е. индекс аллергии даже при тяжелой степени ОЛБ составляет в пределах 2,0-2,5.

Следовательно, сроки появления аллергической реакции на внутрикожное введение препарата у облученных животных позволяют определить стадию болезни: появление реакции на аллерген через 4-6 сут - о начальном периоде лучевой болезни (I стадия), появление гиперергической реакции на аллерген через 24 ч - о стадии появления клинических признаков болезни (II стадия), появление реакции на аллерген в тот же день - о вступлении болезни в стадию разгара (III стадия) и появление реакции на аллерген через 24-48 ч после введения препарата - о стадии реконвалесценции (IV стадия).

Способ получения аллергического препарата и его испытания на облученных животных иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение лучевого аллергена.

Для изолирования специфической аллергенной субстанции клубни картофеля подвергали гамма облучению в дозах 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 Гр, выдерживали их при температуре 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25°С в течение 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ч, снимали верхний слой толщиной 1, 2, 3, 4, 5, 6, см, гомогенизировали в 1-, 2-, 3-, 4-, 5- и 6-кратном объеме 80-, 85-, 90-, 91-, 92-, 93-, 94-, 95-, 96-, 97-, 98%-ном этаноле, экстрагировали в течение 0,5, 10, 1,5, 2, 2,5, 3 ч, отгоняли спирт при 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37°С, выделяли I, II, III, IV, V, VI фракции методом бумажной хроматографии. Устанавливали, что оптимальный выход аллергенного материала (по сухому веществу) достигается при облучении клубней картофеля в дозе 350-400 Гр, выдерживании 23-24 ч при комнатной температуре (18-22°С), снятие верхнего слоя клубней толщиной 3-4 см, экстрагирование 1-1,5 ч, удаление спирта на вакуумном испарителе при температуре 28-33°С и выделение фракции VI фракции путем бумажной хроматографии. Любые изменения параметров получения естественного радиомиметика хиноидного радиотоксина (изменение дозы облучения, времени экстрагирования, соотношение экстрагента, температуры отгонки, изменения фракционного состава и т.д.) не обеспечивали получение активных серий аллергена.

Пример 2. Проверка активности и специфичности лучевого аллергена во внутрикожной реакции на морских свинках.

Для проверки активности и специфичности полученного аллергена в опытах были использованы 30 морских свинок, разделенных на 10 групп по 3 животных в каждой. 1-ю и 2-ю группы животных сенсибилизировали бактериальным антигеном - подкожно вводили сибиреязвенную вакцину СТИ-1 в оптимальной иммунизирующей дозе; 3-ю и 4-ю -иммунизировали ожеговым антигеном от обожженных животных; 5-ю и 6-ю облучали гамма-лучами в дозе 5,5 Гр (ЛД₉₀); 7-ю и 8-ю группы животных не иммунизировали и не облучали (биологический контроль). Через 10 сут после облучения и иммунизации животным 1-й, 3-й, 5-й, 7-й групп внутрикожно в область боковой поверхности спины (предварительно выбрив участок площадью 3х3 см) вводили лучевой аллерген - растительный радиотоксин в 1 кожной дозе (1,5 мкг/ животное), а животным 2-й, 4-й, 6-й и 8-й групп - соответственно тканевый аллерген из тонкого отдела кишечника, полученного от облученных мышей. Читку реакции проводили через 24-48 ч после введения аллергенов. Установлено, что на испытуемый аллерген - радиотоксин положительно с индексом аллергии 2,5-3,2 реагировали только облученные в дозе 5,5 Гр морские свинки. Реакция на аллерген у интактных (необлученных), привитых сибиреязвенной вакциной, а также привитых ожоговым антигеном животных во всех случаях была отрицательной. В отличие от предлагаемого, известный (тканевой) аллерген из кишечника облученных мышей (гетерологичный аллерген) давал ложноположительную реакцию во всех вариантах опытов с индексом аллергии от 1,1 до 2,1 как у облученных, так и у привитых и контрольных животных. Следовательно, предлагаемый аллерген превосходил известный не только по активности, но и по главному критерию - специфичности.

Пример 3. Эффективность предлагаемого аллергена для диагностики радиационных поражений животных и возможность дифференциации летального облучения от сублетального (несмертельного) проверяли на сельскохозяйственных животных, в качестве которых использовали взрослых овец со средней живой массой 35-38 кг, используя по 3 животных на каждый вариант опыта. При этом овец 1-й группы облучали гамма-лучами в летальной (5-6 Гр), 2-й группы - в сублетальной (2,5-3 Гр), 3-й группы - иммунизировали бактериальной (сибиреязвенной) вакциной, 4-й группы подвергали термическому воздействию - ожогу, животных 5-й группы не подвергали никакому воздействию (биологический контроль). Через 24 часа после физического (облучение, ожог) и биологического (иммунизация сибиреязвенной вакциной) воздействия опытным и контрольным животным внутрикожно в область внутренней поверхности бедра вводили предлагаемый растительный аллерген - хиноидный радиотоксин в 1 кожной дозе (1,5 мкг/животное) в объеме 0,1 см³. Читку реакции осуществляли через 24, 48, 72, 96, 120, 144 ч после введения аллергена. Установили, что первая реакция на использованный аллерген проявлялась на 3-4 сут у облученных в летальной (5-6 Гр) дозе овец, в начальные сроки с интенсивностью 2,1-2,7, к 5-6 сут - 3,1-3,5. Внутрикожная реакция на аллерген у животных, облученных в сублетальной (2,5-3 Гр) дозе была менее интенсивной (1,12-1,17) и максимальная реакция (1,19-2,21) у них развивалась к 5-6 сут после облучения. В отличие от облученных животных реакция на испытуемый аллерген у овец, привитых сибиреязвенной вакциной и подвергнутых термическому воздействию (ожогу), во все сроки исследования была отрицательной.

Сравнительная характеристика способов получения лучевых аллергенов и их применение для аллергической диагностики радиационных поражений организма представлены в таблице.

Как видно из таблицы, предлагаемый способ получения антигена для диагностики радиационных поражений организма позволяет исключить из технологического процесса использование дорогостоящих лабораторных или с.-х. животных, их убой, извлечение органов и получение тканевых антигенов, и заменить их легкодоступным и дешевым технологическим сырьем - картофелем, повысить специфичность препарата за счет преодоления тканевого барьера, т.е. исключения из аллергена основного фактора неспецифичности - общегрупповых тканевых антигенов, сократить время изготовления препарата и расширить диапазон его применения, т.е. полученный препарат оптимизирован по биохимическому составу, унифицирован и пригоден для исследования всех видов животных.

Изобретение относится к области радиационной биологии. Предложен способ получения аллергенного препарата для диагностики радиационных поражений организма. Способ предусматривает облучение клубней картофеля дозой 350-400 Гр, последующее извлечение из них хиноидного радиотоксина путем этанолового экстрагирования. Далее проводят удаление экстрагента на ротационном испарителе и дополнительное экстрагирование этилацетатом. В заключение полученную этилацетатную фракцию хроматографируют и разгоняют в системе: а) 2% уксусная кислота, б) смесь бензол - уксусная кислота - вода в соотношении 2:4:1 соответственно. Полученную аллергенную фракцию элюируют 2%-ным раствором уксусной кислоты и стандартизируют по сухому веществу из расчета 1 мг/см³. Предложен также способ диагностики радиационных поражений организма, предусматривающий внутрикожное введение специфического аллергена и выявление аутосенсибилизации. Диагноз на лучевую болезнь устанавливают по индексу аллергии (ИА). Предложенные способы позволяют получать специфический лучевой аллерген для выявления радиосенсибилизации организма и проводить диагностику лучевой болезни. Изобретение может быть использовано в радиационной биологии. 1 табл.

1. Способ получения аллергенного препарата для диагностики радиационных поражений организма, включающий извлечение из облученных в дозе 350-400 Гр клубней картофеля хиноидного радиотоксина путем этанолового экстрагирования, удаления экстрагента на ротационном испарителе, подкисления осадка соляной кислотой до рН 7,2 и дополнительного экстрагирования этилацетатом, отличающийся тем, что полученную этилацетатную фракцию подвергают хроматографической очистке путем нанесения вышеуказанной фракции на хроматографическую бумагу (20×20 см) и разгоняют в системе: а) 2%-ная уксусная кислота; б) смесь бензол - уксусная кислота - вода в соотношении 2:4:1 соответственно; полученную специфическую аллергенную фракцию из хроматограммы элюируют 2%-ным раствором уксусной кислоты, а конечный продукт стандартизируют по сухому веществу из расчета 1 мг/см³.2. Способ диагностики радиационных поражений организма, включающий внутрикожное введение специфического аллергена и выявление аутосенсибилизации, отличающийся тем, что в качестве специфического аллергена животным вводят очищенную фракцию растительного хиноидного радиотоксина в объеме 0,1-0,2 см³ (1,5-2,0 мкг на животное) в область внутренней поверхности бедра (у овец и коз), в верхней трети спины (у крупного рогатого скота и лошадей) и тыльной стороне у основания уха (свиней), а выявление аутосенсибилизации устанавливают по реакции организма (кожи) на месте инъекции аллергена через 24, 48, 72, 96, 120, 144 ч после облучения и по индексу аллергии (ИА), равному или превышающему 1,12 (ИА≥1,12), устанавливают диагноз на лучевую болезнь.