СПОСОБ ОЦЕНКИ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/49 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии и терапии.

Известны способы оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) крови при ишемической болезни сердца (ИБС) (В.З. Ланкин, А.Н. Закирова, Б.Х. Ахметова и соавт. Перекиси липидов и атеросклероз, кардиология, 1980, N 7, с. 96 - 98); способ определения малонового диальдегида в плазме крови в сопоставлении с уровнем линолеата сыворотки липопротеинов (Атеросклероз, 1994, N 1, т. 108, с. 103 - 110), а также известно защитное действие липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), их подфракций и ЛХАТ в перекисной модификации липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) (А.Н. Климов, А.А. Никифорова, В. М. Плесков, А. А. Кузьмин, Н.Н. Калашникова, Т.О. Антипова//Биохимия, 1979, N 1, с. 118 - 123).

Описанные способы не позволяют оценить резервную мощность общей антиоксидантной активности крови (AOA).

Описан также способ оценки антиоксидантной активности крови путем исследования аскорбатзависимого перекисного окисления липидов в тканях при помощи теста с 2-ТБК (В.З. Ланкин, С.М. Гуревич, Е.Б. Бурлакова, Биоантиокислители. - М.: Наука, 1975, с. 73 - 78).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом). Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет определить лаг-период (период индукции прироста ТБК-активных соединений сыворотки крови, условно называемых малоновым диальдегидом (МДА) и не позволяет оценить резервную мощность общей антиоксидантной активности (АОА) крови, так как не позволяет определить границ, характерных для высокой, средней, низкой резервной мощности АОА крови.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности способа. Указанная цель достигается техническим решением, представляющим собой одновременное определение концентрации 2-ТБК активных соединений в сыворотке крови и дополнительное определение лаг-периода (периода прироста ТБК-активных соединений (МДА) сыворотки крови) и холестерола липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и при увеличении концентрации МДА с 0,1 до 0,13 мкмоль/г общих липидов (ОЛ) при значениях ХС ЛПВП в пределах 1,4 - 1,7 мкмоль/л и лаг-периоде с 9,1 до 10 мин резервную мощность общей АОА считают высокой, при увеличении МДА до 0,13 - 0,61 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП в пределах 0,92 - 1,39 ммоль/л и лаг-периоде 6 - 9 мин резервную мощность общей АОА считают умеренной и при увеличении МДА до 0,62 - 2,1 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП 0,61 - 0,91 ммоль/л, лаг-периоде 2 - 5,9 мин резервную мощность общей АОА считают низкой.

Известно, что основной антиоксидант крови - альфа-токоферол содержится в значительном количестве в липопротеинах высокой плотности (ЛПВП). Поэтому резервная мощность АОА крови зависит от концентрации в крови ЛПВП и, следовательно, только комплексная оценка указанных выше показателей позволяет определить границы резервной мощности АОА.

Новым в данном способе является дополнительное определение лаг-периода, ХС ЛПВП и при увеличении концентрации МДА с 0,1 до 0,13 мкмоль/г ОЛ при значениях ХС ЛПВП в пределах 1,4 - 1,7 мкмоль/л и лаг-периоде с 9,1 до 10 мин резервную мощность общей АОА считают высокой; при увеличении МДА до 0,14 - 0,61 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП в пределах 0,92 - 1,39 ммоль/л и лаг-периоде 6 - 9 мин резервную мощность общей АОА считают умеренной и при увеличении МДА до 0,62 - 2,1 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП 0,61 - 0,91 ммоль/л, лаг-периоде 2 - 5,9 мин резервную мощность общей АОА считают низкой.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности способа.

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно успешно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "практическая применимость" и "изобретательский уровень".

В настоящее время установлена активация ПОЛ при ИБС (Ланкин В.З., 1980 - 1988 гг. ), связанная со снижением общей АОА крови. В результате активации процессов ПОЛ при атерослерозе появляются модифицированные формы липопротеидов, являющихся наиболее атерогенными (Кузнецов А.С. и соавт., 1989). Поэтому оценка резервной мощности АОА крови при ИБС крайне важна для прогнозирования течения заболевания, оценки эффективности проводимой терапии. Верхняя граница резервной мощности АОА крови является пределом нормы для homo sapiens, нижняя свидетельствует о возможности срыва компенсаторных механизмов гомеостаза организма с тяжелым клиническим исходом.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения резервной мощности общей АОА крови. Следовательно, указанный способ позволяет дополнительно к определению ЛПВП и концентрации МДА крови проводить оценку мощности общей антиоксидантной активности крови.

Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивают по определению окрашенных продуктов реакции сыворотки крови с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК). Популярность этого метода обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Гаврилов В.Б. и соавт. Вопросы медицинской химии, 1987, N 1, с. 118 - 122). В то же время 2-ТБК может взаимодействовать с некоторыми веществами нелипидной природы. Альдегидами (моносахаридами и др.), ароматическими альдегидами, силовыми кислотами, пиримидинами, фосфоэнолпируватом, ацетальдегидом, 2-дезокси-Д-рибозой, простагландинами, желчными пигментами и т.д. (А. Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров. Активные формы кислорода и их роль в организме. В кн.: Успехи биологической химии. - М.: Наука, 1990, т. 31, с. 180 - 208). Тем не менее спектры комплексов 2-ТБК с продуктами окисления ненасыщенных липидов организма идентичны спектру хромогена, образующегося при реакции 2-ТБК с МДА. Следовательно, в условиях выбранного нами метода МДА является продуктом окисления ненасыщенных липидов и реагирующим с 2-ТБК (Биоокислители. - М: Наука, 1975, с. 73 - 78). Поэтому для удобства изложения в тексте идет речь об МДА, а не о 2-ТБК активных соединениях.

Метод основан на том, что при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагается с образованием МДА, который связывается с двумя молекулами 2-ТБК. Взаимодействие 2-ТБК с МДА, исходно содержащимся в липидных системах, и с другими летучими продуктами окисления липидов в количественном отношении невелико (см. контрольные исследования).

Хорошо известно, что МДА образуется при окислительной деструкции гидроперекисей в процессах ПОЛ и составляет 1 - 2% от количества МДА, образующегося в ходе теста (см. ниже) в результате нагревания исследуемой пробы в присутствии прооксидантов.

Способ осуществляют следующим образом: в сыворотке крови определяют концентрацию 2-ТБК-активных соединений, а именно к 0,17 мл сыворотки крови добавляют инкубационную смесь следующего состава - 30 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 145 мМ NaCl, 0,67 мМ аскорбиновой кислоты. Реакцию инициируют добавлением раствора Fe₂SO₄ до его конечной концентрации 25 мкМ. Общий объем смеси составляет 2,0 мл. Инкубация длится 5, 10 и 15 мин при 37^oC. Малоновый диальдегид в пробе определяют с 10 мл 0,75%-ным раствором 2-тиобарбитуровой кислоты. Коагулированный белок отделяют центрифугированием, супернатант спектрофотометрируют при 532 нм. Исходный уровень МДА в анализируемой сыворотке определяют без предварительной инкубации в присутствии прооксидантов. До инкубации оценивают только уровень МДА, который составляет в группе контроля 0,01±0,001 мкмоль/г ОЛ и во всей второй группе 0,1±0,01 мкмоль/г ОЛ; уровень ХС ЛПВП в процессе инкубации пробы не изменялся, лаг-период оценивают в динамике инкубации пробы.

ХС ЛПВП определяют после осаждения ЛПНП и ЛПОНП марганец-гепариновой смесью, стандартизированным методом с использованием контрольных сывороток, регулярно поставляемых центром по стандартизации липидных исследований ВНИИЦП МЗ России. (Методические рекомендации МЗ РФ. Методы клинической химии в кардиологии, 1987, с. 26).

Лаг-период оценивают следующим образом. Обсчитывают суммарную кинетическую кривую в контроле и в двух обследованных группах. Функция кривой по виду напоминает экспоненциальную, однако для удобства расчета каждую кривую аппроксимируют двумя отрезками прямых (двумя касательными) и в точке их пересечения находят значение лаг-периода. Для каждой прямой решают уравнение, полученное эмпирически: в группе контроля (n = 11) уравнение первой прямой E₁ = +0,03 + 0,025•T; уравнение второй прямой: E₂ = -2,4 + 0,65•T.

У этих людей в возрасте 26 - 35 лет уровень МДА после 15-минутной инкубации пробы возрос до 0,13 мкмоль/г ОЛ при значениях ХС ЛПВП в пределах 1,4 - 1,7 мкмоль/л и лаг-периоде 9,1 - 10 мин, то есть резервная мощность общей АОА у них считается высокой.

Вторая группа составила 83 человека (пациенты возраста 45 - 64 года). Согласно полученным после графического анализа данных результатам все пациенты были разделены на 2 подгруппы (n = 59, средний возраст 45 - 54 года и n = 24, средний возраст 55 - 64 года).

Для каждой из этих подгрупп решают уравнение, полученное эмпирическим путем. Приводим средние значения уравнений этих подгрупп (см. таблицу).

У пациентов этих двух подгрупп увеличение концентрации МДА до 0,14 - 0,61 мкмоль/г ОЛ при уровне ХС ЛПВП в пределах 0,92 - 1,39 ммоль/л и лаг-периоде 6 - 9 мин резервную мощность АОА считали умеренной, а при увеличении концентрации МДА до 0,62 - 2,1 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП 0,61 - 0,91 ммоль/л, лаг-периоде 2 - 5,9 мин резервную мощность общей АОА считали низкой.

Приводим среднестатистические данные по группам с высокой (контроль), умеренной и низкой резервной мощностью общей АОА:
Контроль (n = 11):
уровень МДА по инкубации пробы 0,01±0,001 мкмоль/г ОЛ;
уровень МДА после инкубации пробы 0,115±0,01 мкмоль/г ОЛ;
ХС ЛПВП 1,65±0,11 ммоль/л (верхняя граница популяционной нормы г. Томска) - 1,7 ммоль/л);
лаг-период 9,5±0,6 мин.

Вторая группа с умеренной резервной мощностью общей АОА (n = 59):
уровень МДА до инкубации пробы 0,1±0,01 мкмоль/г ОЛ;
уровень МДА после инкубации пробы 0,28±0,02 мкмоль/г ОЛ;
ХС ЛПВП 1,3±0,07 ммоль/л;
лаг-период 7,5±0,5 мин
Третья группа с низкой резервной мощностью АОА (n = 24):
уровень МДА до инкубации пробы 0,1±0,01 мкмоль/г ОЛ;
уровень МДА после инкубации пробы 0,9±0,05 мкмоль/г ОЛ;
ХС ЛПВП 0,76±0,04 ммоль/л (нижняя граница популяционной нормы г. Томска - 0,91 ммоль/л);
лаг-период 4,1±0,3 мин.

Приводим примеры суммарных кинетических кривых трех групп (контроля - I группа, второй и третьей групп) (см. чертеж).

Использование предлагаемого способа позволило в группе контроля (возраст 26 - 35 лет) выявить высокую резервную мощность общей антиоксидантной активности крови; у 59 пациентов в возрасте 45 - 54 года - умеренную резервную мощность антиоксидантной активности крови; у 24 пациентов пожилого возраста (55 - 64 года) выявлена низкая резервная мощность АОА, что позволяет рекомендовать им дальнейшее клинико-лабораторное обследование.

Применение предлагаемого способа для оценки общей антиоксидантной активности крови в отличие от способа-прототипа позволяет более точно оценить интенсивность прироста МДА в крови в связи с дополнительным определением лаг-периода, ХС ЛПВП. Дополнительное определение лаг-периода и ХС ЛПВП позволило разработать критерии оценки резервной мощности АОА и определить границы высокой, умеренной и низкой резервной мощности общей АОА, что повысило точность способа. При этом предлагаемый способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов.

Способ может быть использован в медицине, в кардиологии. Одновременно исследуют прирост 2-ТБК активных соединений (малоновый диальдегид (МДА)), уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и определяют лаг-период. По величине и соотношению у исследованных показателей оценивают общую антиоксидантную активность крови как высокую, умеренную и низкую. Способ позволяет повысить точность и уменьшить время исследования. 1 табл., 1 ил.

Способ оценки общей антиоксидантной активности крови (АОА) путем определения концентрации 2-ТБК активных соединений в сыворотке крови, отличающийся тем, что дополнительно определяют лаг-период, ХС ЛПВП и при увеличении концентрации МДА с 0,1 до 0,13 мкмоль/г общих липидов (ОЛ) при значениях ХС ЛПВП в пределах 1,4 - 1,7 мкмоль/л и лаг-периода с 9,1 до 10 мин резервную мощность общей АОА считают высокой, при увеличении МДА до 0,14 - 0,61 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП в пределах 0,92 - 1,39 ммоль/л и лаг-периоде 6 - 9 мин резервную мощность общей АОА считают умеренной и при увеличении МДА до 0,62 - 2,1 мкмоль/г ОЛ, уровне ХС ЛПВП 0,61 - 0,91 мкмоль/л, лаг-периоде 2 - 5,9 мин резервную мощность общей АОА считают низкой.