Способ определения продуктов перекисного окисления липидов крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к клинической медицине и биологии, а именно к способам контроля уровня перекисного окисления ли- пидов (ПОЛ) крови доноров в зависимости от возраста, пола, географической широты обитания, и может быть использовано для диагностики патологий, протекающих с изменением уровня перекисного окисления липидов, для контроля адаптации к мобильным формам организации труда, новым кли- мато-географическим условиям, способам контроля антиоксиданто- витамине-, гемотерапии.

Цель изобретения -упрощение способа за счет сокращения ччсла трудоемких операций и расширение возможностей способа за счет использования цельной крови или ее фракций при одновременном повышении точности.

Способ осуществляется следующим образом.

0,02-0,1 мл цельной крови или плазмы крови, или эритроцитов экстрагируют 100- 500-кратным избытком бинарной смеси гептан- изопропиловый спирт 1 :1(по объему), делят фазы, отбирают 0,5 мл гептаново- го экстракта, смешивают с 0,5 мл раствором 2-тиобарбитуровой кислоты до конечной ее концентрации 0,33-0,5%, термостатируют 5-15 мин при (105-115)J0,2°C с обратным холодильником, охлаждают, добавляют 5- 10 мл н-бутанола, результаты флуориметри- рования выражают в единицах отношения интенсивностей

ТБЧ

где ТБЧ - тиобарбитуровое число;

I - интенсивность флуоресценции рабочего (Ip) и фонового (1ф) раствора.

П р и м е р 1. Пробу плазмы донора Б 27 лет объемом 0,02 мл смешивают со 100-кратным избытком смеси гептан - изопропанол в соотношении 1:1 по объему. Отбирают 0,5 мл гептанового экстракта, добавляют 0,5 мл 1 %-ного водного раствора тиобарбитуровой кислоты (конечная ее концентрация в пробе 0,5%), термостатируют при 115+0,2°С в течение 5 мин, охлаждают до комнатной темХ|

СО

VI

CJ

ы о

пературы, добавляют 10 мл н-бутанола. Образуется прозрачный раствор, который флу- ориметрируют при волне возбуждения 515 нм и волне флуоресценции 535 нм против бутанола. Параллельно анализируют 6 проб, получая среднее значение показателя ТБЧ, равное 3,21 ±0,61.

П р и м е р 2. Пробу эритроцитов белых крыс объемом 0,1 мл смешивают с 500-кратным избытком бинарной смеси гептан-изо- пропанол в соотношении 1:1 по объему, отбирают0,5 мл гептановой фазы, добавляют 0,5 мл 0,67%-ного водного раствора тио- барбитуровой кислоты (конечная концентрация 0,33%), термостатируют 10 мин при ,2°С, охлаждают, смешивают с б мл н-бутанола, флуориметрируют при волне возбуждения 515 нм и волне флуоресценции 535 нм против бутанола. Параллельно анализируют 3 пробы, получают среднее значение показателя, равное 2,76±0,55.

П р и м е р 3. Пробу цельной крови донора В. 30 лет объемом 0,02 мл гомогенизируют с 300-кратным избытком смеси геп- тан-изопропанол в соотношении 1:1 по объему, центрифугируют для разделения фаз, отбирают 0,5 мл гептановой фазы, добавляют водный раствор тиобарбитуровой кислоты до конечной ее концентрации 0,4%, термостатируют в течение 15 мин при 105°С, охлаждают, смешивают с 5 мл н-бутанола, флуориметрируют прозрачный раствор при волне возбуждения 515 нм и волне флуоресценции 535 нм против бутанола. Па

раллельно анализируют 5 проб и получают среднее значение ТБЧ, равное 2,70±0,25.

По сравнению с прототипом в предлагаемом способе сокращено 11 трудоемких операций, способ позволяет использовать не только плазму крови, но и цельную кровь и ее фракции. Достоверный анализ по прототипу производится в пробе объемом не менее 0,03-0,05 мл, а по предлагаемому способу - начиная с 0,01 мл, причем воспроизводимость способа возрастает не менее чем в 1,5 раза.

Формула изобретения Способ определения продуктов пере- кисного окисления липидов крови, включающий добавление к исследуемой пробе 2-тиобарбитуровой кислоты, нагревание, охлаждение, добавление н-бутанола и флуори- метрический анализ, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа трудоемких операций и расширения возможностей способа путем использования цельной крови или ее фракций при одновременном повышении точности, исследуемую пробу экстрагируют 100-500-кратным избытком смеси гептан- изопропанол в соотношении 1:1, аликвоту гептановой фазы смешивают с водным раствором 2-тиобарбитуровой кислоты при ее конечной концентрации в смеси 0,33-0,5%, проводят нагревание при 105-115°С в течение 5-15 мин, охлаждают, добавляют н-бутанол в объемном соотношении к пробе 1 : (5-10).

Использование: медицина, биология, диагностика патологий, контрольадаптациитерапии. Сущность изобретения: пробу крови или ее фракций экстрагируют 1UU-bUU -кратным избытком смеси гептан-изопропанол в соотношении 1:1, аликвоту гептановой фазы смешивают с водным раствором 2-тиобар- битуровой кислоты при ее конечной концентрации в смеси 0,33-0,5%, проводят нагревание при 105-115°С в течение 5-15 мин и добавляют после охлаждения н-бута- нол в объемном соотношении к пробе 1 :