СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ И АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/725 A61K31/73 

Изобретение относится к медицине и может найти применение для профилактики и лечения тромбозов.

Известен гепарин, являющийся антикоагулянтом прямого действия и проявляющий антитромботический эффект.

Актуальность поиска новых антикоагулянтов прямого действия связана с ростом потребления гепарина, его высокой стоимостью и ограниченностью источников сырья для его производства, а также с наличием ряда побочных нежелательных эффектов, возникающих при длительном лечении с использованием этого лекарства. Основным материалом для получения высокоэффективных заменителей гепарина являются его структурные аналоги гликозаминогликаны синтетического и полусинтетического происхождения. Известно, что в комбинации с гепарином соли или комплексы солей эфиров полисерных кислот, полиуронидов, гликозаминоликанов (сернокислые эфиры декстрана, пектина, хондроитина и др.) проявляют потенциирующее действие антикоагулянтной активности гепарина в экспериментах ин виво и ин витро. При этом, например, низкомолекулярные гликозаминогликаны, не являясь сильными антикоагулянтами, могут вводится в больших дозах, так как обладают малой токсичностью.

Объект изобретения средство, тормозящее свертывание крови и обладающее антитромботической активностью, являющееся смесью гепарина (Г) с его структурным аналогом сернокислым эфиром хитозана (СХ) (удельной активностью 20 ЕД/мг) в массовом соотношении 1 1.

Для определения удельной антикоагулянтной активности образцов СХ с различным содержанием серы и различной вязкостью применяли тест тромбинового времени, в качестве стандарта использовали гепарин фирмы "Abbott" (США) 171 ЕД/мг (см. табл. 1). Наблюдалась удельная антикоагулянтная активность от 2,0 до 30,0 ЕД/мг.

Исследуя способность образцов СХ потенциировать антикоагулянтную активность гепарина в экспериментах ин витро, было обнаружено, что она коррелирует с активностью образца (см. табл. 1). Чем выше антикоагулянтная активность образца СХ, тем сильнее проявляется его потенциирующее действие по отношению к гепарину (r 0,92). Исследование оптимального соотношения гепарина и СХ, проявившего наибольший потенциирующий эффект (удельная активность 20 ЕД/мг, сера 13,7 характеристическая вязкость 0,28 дл/г) в смеси показали, что увеличение потенциирования с 1,95 0,15 при соотношении 1 1 до 2,30 ± 0,15 при соотношении 1 10 недостоверно (p < 0,1) (см. табл. 2). Таким образом, для достижения эффекта достаточно использовать комбинацию гепарина и СХ в массовом соотношении 1 1.

Оценка потенциирующего эффекта в условиях внутривенного введения гликозаминогликанов кроликам показали, что достижения эффекта гепарина (40 ЕД/мг) в дозе 1 мг на кг, СХ (20 ЕД/мг) требуется в 10 раз больше (p < 0,1) (см. табл. 3). Потенциирование в два раза наблюдалось при введении смеси в дозе (0,5 мг/мг Г ± 5,0 мг/кг СХ), что соответствует соотношению 1 10 и совпадает с показаниями в опытах ин витро 2,30 ± 0,15. Введение смеси в дозе (0,5 мг/кг Г ± 0,5 мг/кг СХ) вызывало такой же эффект, как и введение гепарина в дозе 1 мг/кг (p < 0,1). Таким образом, достигался равный антикоагулянтный эффект вдвое меньшим количеством гепарина. Важной стороной антикоагулянтного эффекта является способность вызывать кроветечения, это остается большой проблемой, особенно при лечении больных из группы риска. Поэтому для оценки геморрагической активности изучаемые вещества вводили внутривенно крысам в дозах от 12 до 160 ЕД/мг, эффект регистрировали по выходугемоглобина под действием гепарина, СХ и смеси (Г + СХ) (см. табл. 4). Сравнивая показатели, можно заметить, что действие СХ в дозе 20 ЕД/кг не отличается от действия 0,15 М NaCl (p < 0,1), а для достижения равного геморрагического эффекта (136 ) СХ требуется в 10 раз больше, чем гепарина. Геморрагический эффект смеси (Г + СХ) приблизительно в два раза ниже такового у гепарина, с увеличением дозы достоверность различий возрастает с вероятности p < 0,05 при дозе 30 ЕД/кг до вероятности p < 0,001 при дозе 120 ЕД/кг. Таким образом, геморрагический эффект в смеси (Г + СХ) ниже, чем у гепарина, при одинаковой силе антикоагулянтного эффекта.

При лечении гепарином приходится подбирать такую дозу препарата, которая ограничена, с одной стороны, невысоким геморрагическим эффектом, а, с другой стороны, достаточным антитромботическим. Способность СХ и смеси (Г + СХ) ингибировать образование тромба на модели стаза в сравнении с гепарином отражена в табл. 5. Максимальный антитромботический эффект для гепарина (0,20 ± 0,08) и смеси Г + СХ (0,30 ± 0,09) наблюдается на 15 мин после введения при дозе 70 ЕД/кг. Причем СХ в той же дозе имеет антитромботическую активность меньшую (2,50 ± 0,06), то есть и в этом случае наблюдается потенциирование.

Таким образом, вводя внутривенно вместо 2 мас. ч. гепарина 1 мас. ч. гепарина и 1 мас. ч. СХ, можно добиться уменьшения расхода гепарина и снижения его геморрагического эффекта с сохранением антитромботической и антикоагулянтной активности.

Пример 1. Для определения антикоагулянтной активности образцов СХ брали кровь у пяти здоровых доноров общего пола в объемном соотношении 9 1 с 3,8 раствором двухводного трехзамещенного цитрата натрия. После центрифугирования при 2000 g в течение 20 мин при температуре 4^oC отбирали плазму. 0,2 мл плазмы с различным содержанием образцов СХ (0,90 24,0 мг/мл плазмы) прогревали в течение 3 мин в пластиковой кювете до 37^oC, затем добавляли 0,1 мл коммерческого бычьего тромбита (0,8 1Н ЕД/мл) в 0,05 М трис-Н01 буфере с 0,15 М NaCl, рН 7,4 и регистрировали время свертывания. Для построения калибровочной кривой использовали гепарин фирмы "Abbott" (США) 171 ЕД/мг в следующих концентрациях: 0,10; 0,27; 0,53; 0,79; 1,06 мг/мл.

Образцы СХ имели следующие удельные активности: 2,0 ЕД/мг у образца с серой 9,9 и вязкостью 0,28 дл/г; 14,0 ЕД/мг у образца с серой 15,4 и вязкостью 0,18 дл/г; 3,4 ЕД/мг у образца с серой 11,0 и вязкостью 0,41 дл/г; 19,0 ЕД/мг у образца с серой 14,3 и вязкостью 0,25 дл/г; 20,0 ЕД/мг у образца с серой 13,7 и вязкостью 0,28 дл/г.

Пример 2. Для оценки потенциирования антикоагулянтной активности гепарина образцами СХ в экспериментах ин витро применяли тест рекальцификации цитратной плазмы. Для получения плазмы смешивали кровь кролика с 3,8 раствором двухводного трехзамещенного цитрата натрия в соотношении 9 1, затем центрифугировали 20 мин при 2000g. К 0,1 мл 0,05 М раствора СаСl₂, прогретого 1 мин до 37^oС, добавляли 0,1 мл плазмы с образцом СХ или гепарином и регистрировали время свертывания. Концентрации СХ и гепарина выражали в мг Для подсчета потенциирования пользовались следующей формулой: (А-В)/С потенциирование, где А концентрация гепарина, при которой время рекальцификации равно 5 мин; В концентрация гепарина, эквивалентная концентрации СХ в смеси с гепарином, дающей время рекальцификации 5 мин; С - реальная концентрация гепарина в смеси с СХ, при которой время рекальцификации составляет 5 мин. Замечено, что, чем выше антикоагулянтная активность образца СХ, тем сильнее проявляется его потенциирующий эффект. Так, образец с активностью 2,0 ЕД/мг имел степень потенциирования 0,10 ± 0,05, а образец с наибольшей активностью (20,0 ЕД/мг) 1,95 ± 0,14.

Пример 3. Оценку потенциирования антикоагулянтного действия гепарина с образцом СХ ин виво проводили на кроликах. Изучение вещества вводились внутривенно в следующих дозах, мг/кг: гепарин 1,0; СХ 10,0; (Г + СХ) 0,5 ± 5,0 и 0,5 ± 0,5. Через 0, 30, 60, 90, 120, 180 мин после введения для получения плазмы отбирали кровь в соотношении 9 1 с двухводным трехзамещенным цитратом натрия, затем центрифугировали 20 мин при 2000g. К 0,1 мл 0,05 М раствора СаCl₂, прогретого 1 мин до 37^oC, добавляли 0,1 мл плазмы и регистрировали время свертывания. Внутривенное введение гепарина в дозе 1 мг/кг равнозначно введению СХ в дозе 10 мг/кг (p < 0,1). При введении смеси (Г + СХ) в половинных дозах от вышеобозначенных (0,5 ± 5,0 мг/кг) наблюдалась разница в два раза, в сравнении с отдельным введением компонентов (p < 0,05). Смесь (Г + СХ) в дозе 0,5 ± 0,5 мг/кг проявляла такой же эффект, так и гепарин в дозе 1 мг/кг (p < 0,1).

Пример 4. Геморрагическая активность смеси гепарина с СХ определялась на крысах обоего пола весом 200 250 г, которых наркотизировали внутрибрюшинным введением этаминала натрия в дозе 500 мг/кг. В яремную вену вводили СХ, СХ + гепарин или гепарин в следующих дозах: 20, 30, 40, 60, 80, 160 ЕД/кг. Через 30 с надрезали кожу на спине. Под кожу на глубину 10 см вводили острые концы ножниц, раздвигали бранши на 4 см и в таком положении извлекали ножницы, достигая таким образом отсепарирования кожи от поддерживающих тканей. Под кожу помещали маpлевую салфетку pазмеpом 14x14 см. Чеpез 30 мин пpоводили гемолиз эритроцитов, помещая салфетку в стеклянную пробирку и заливая 10 мл дистиллированной воды. Через 2 ч после полного гемолиза клеток пробы спектрофотометрировали при длине волны 540 нм, определяли в них содержание гемоглобина. Действие СХ в дозе 20 ЕД/кг не отличалось от действия 0,15 М NaCl, а для достижения равного геморрагического эффекта СХ требовалось в 10 раз больше, чем гепарина. Геморрагический эффект смеси Г + СХ приблизительно в два раза ниже такого у гепарина.

Пример 5. Антибромотическую активность оценивали на модели става по S. Wessler. В опытах использовали белых крыс обоего пола массой 200 250 г. Для наркоза брали этаминал натрия, который вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг по 1 мл на 200 г веса животного. Через 15 или 30 мин после внутривенного введения СХ, гепарина или смеси СХ + Г в дозах 35, 70, 250 ЕД/кг внутривенно вводили активированную стеклом плазму человека (1,5 мл/кг). Затем через 30 с перевязывали двухсантиметровый участок яремной вены. Через 10 мин его удаляли и помещали в чашку Петри для определения формы сгустка в баллах от 0 до 4. 0 и 1 балл выраженный антитромботический эффект, в поле зрения сгустка нет или наблюдается несколько макроскопических нитей; 2 балла умеренный антитромботический эффект, в поле зрения несколько маленьких тромбиков; 3 и 4 балла эффект отсутствует или незначителен, в поле зрения один большой или 2 тромба меньшего размера. Максимальный антитромботический эффект гепарина (0,20 ± 0,08) в смеси гепарин ± СХ (0,30 ± 0,09) наблюдается на 15 мин после введения при дозе 70 ЕД/кг. СХ в той же дозе имел антитромботическую активность 2,50 ± 0,06. Длительность действия исследовательских веществ составила 60 мин. То есть, наблюдали потенциирование антитромботической активности гепарина сернокислым эфиром хитозана.

Использование: изобретение относится к медицине и может найти применение для профилактики и лечения тромбозов. Сущность изобретения: новое лекарственное средство, состоящее из смеси равных количеств гепарина и сернокислого эфира хитозана с вязкостью 0,2 - 0,4 дл/г и содержанием серы 13,0 - 15,0 %, является антикоагулянтом прямого действия. Внутривенное введение нового средства позволяет добиться уменьшения расхода гепарина и снижения его геморрагического эффекта при сохранении антитромботической и антикоагулянтной активностей. 5 табл.

Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромботической активностью, содержащее гепарин, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит сернокислый эфир хитозана с вязкостью 0,2 0,4 дл/г и содержанием серы 13 - 15% при массовом соотношении указанных ингредиентов 1:1.