ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР РЕАГЕНТОВ "CIS-ТЕСТ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 C07K2/00 C07K14/705 C07K16/28 C07K17/00 G01N33/535 G01N33/53 A61K39/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к наборам реагентов для выявления состояния головного мозга млекопитающих, в частности для диагностики неврологических заболеваний.

Заявляемый диагностический набор реагентов для выявления ишемической болезни головного мозга является новым и аналогов не обнаружено.

Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что диагностика ишемической болезни головного мозга проводится путем сравнительного определения в крови пациента аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку.

Сущность изобретения.

Принцип работы диагностического набора реагентов CIS-тест состоит в выявлении аутоантител к синтетическому фрагменту ФМБ головного мозга человека. Сорбция синтетического фрагмента ФМБ на поверхности твердого носителя позволяет избирательно извлекать аутоантитела из сыворотки крови (20 микролитров), взятой у пациента из вены или из пальца. Образовавшийся комплекс антиген - антитело выявляется с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой. Уровень аутоантител к ГМБ оценивается по изменению окраски субстратной смеси, регистрируемой с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 405 нм.

Синтетический пептидный фрагмент фенциклидинсвязывающего мембранного белка наносится на твердый носитель (полистироловый микропланшет для иммунологических исследований или нитроцеллюлоза) и инкубируется в течение 14-16 ч при +4^oC для получения иммуносорбента. В ходе испытаний образцы сыворотки крови пациентов и здоровых лиц наносили на иммуносорбент. В качестве положительного контроля служила кроличья антисыворотка к синтетическому пептидному фрагменту фенциклидинсвязывающего мембранного белка, наносимая в лунки планшета параллельно с исследуемыми образцами в концентрации от 1 до 50 нг/мл по белку. После нанесения образцов иммуносорбент инкубировали 1 час при температуре 20-25^oC и уровень связывания с иммуногенным фрагментом фенциклидинсвязывающего мембранного белка определяли по стандартной методике твердофазного иммуноферментного анализа, используя кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека, конъюгированные с пероксидазой хрена. Отсчет результатов производили с помощью спектрофотометра вертикального сканирования Dynatech 4000 (Англия) по величине поглощения растворов (E₄₀₅) при длине волны 405 нм. Строили калибровочную кривую для положительного контроля, откладывая по оси абсцисс концентрацию антител, по оси ординат - величину E₄₀₅. Концентрацию аутоантител в пробах определяли по калибровочной кривой на основании величин E₄₀₅.

Содержание аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в крови здоровых лиц было 0,9-1,5 нг/мл. Содержание аутоантител свыше 1,5 нг/мл было обнаружено в крови больных с диагнозом "ишемическая болезнь головного мозга".

Количественное содержание антител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в крови тесно коррелирует с функциональным состоянием больных ишемической болезнью головного мозга. Наличие специфических аутоантител к этим белкам в крови свидетельствует о проявлении иммунной реакции организма в ответ на нарушение обмена определенных белков головного мозга при острой гипоксии. Достоверный стабильный уровень антител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку свидетельствует о предрасположенности к ишемической болезни головного мозга, а изменение, и в том числе резкое накопление этих антител у пациентов, служит критерием их функционального состояния.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

CIS-тест состоит из следующих компонентов:
- планшеты 96-луночные полистироловые стриповые с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок ФМБ - 2 шт.;
- конъюгат кроличьих поликлональных антител к иммуноглобулинам класса G человека, меченный пероксидазой, лиофилизированный - 1 фл.;
- положительный контрольный образец (поликлональные антитела к ФМБ в концентрации 50 нг/мл), лиофилизированный - 1 фл.;
- фосфатно-солевой буфер - 1 фл. (10 таблеток);
- цитратный буфер - 1 фл. (4 таблетки);
- детергент твин-20 - 1 фл. (0,6 мл);
- 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) (АБТС) - 1 фл. (2 таблетки);
- гидроперит - 1 фл. (2 таблетки).

Набор CIS-тест рассчитан на проведение анализа в трипликатах 43 исследуемых сывороток крови и 5 образцов положительного контроля в концентрации 1-50 нг/мл (всего 144 определения).

Пример 2.

Состав комплекта CIS-теста:
А. Тест карты с нитроцеллюлозным окошком для анализа капли крови пациента - 30 шт.

Б. Скарификаторы (стерильные) - 30 шт.

Пластырь бактерицидный - 30 шт.

Упаковка картонная - 1 шт.

К каждому набору прилагается инструкция по использованию теста. CIS-тест основан на качественном твердофазном конкурентном иммунохроматографическом связывании антигена мозга с аутоантителами крови пациента. Нитроцеллюлоза содержит окрашенный комплекс синтетического пептидного фрагмента ФМБ с положительным контролем в концентрации 2 нг/мл и вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, окрашенными субстратом АБТС. Капля крови из пальца пациента наносится на нитроцеллюлозное окошко, содержащее окрашенную полоску, через 15 мин кровь стряхивается и фиксируется результат анализа. При наличии ишемического процесса в головном мозгу аутоантитела из крови пациента вступают в конкурентную реакцию с антигеном на нитроцеллюлозе и вытесняют их, вследствие чего окрашенная полоса исчезает.

Заявляемый диагностический набор реагентов CIS-тест позволяет быстро и эффективно провести диагностику ишемической болезни головного мозга у значительного числа пациентов одновременно. Кроме того, заявляемый диагностический набор реагентов CIS-тест позволяет проводить профилактические обследования больших групп населения с целью выявления группы риска по заболеванию.

Изобретение предназначено для выявления состояния головного мозга млекопитающих и, в частности, для диагностики неврологических заболеваний. Набор реагентов "CIS-тест" предназначен для количественного иммуноферментного определения содержания аутоантител к синтетическому фрагменту фенциклидинсвязывающего мембранного белка (ФМБ) головного мозга человека в сыворотке крови людей с ишемической болезнью головного мозга. ФМБ является компонентом сложного рецепторного белка мембран нейронов, нарушение функции которого может приводить к патологическим изменениям в ЦНС. Увеличение уровня аутоантител к ФМБ в сыворотке крови коррелирует с наличием и предрасположенностью к ишемической болезни головного мозга. Изобретение позволит эффективно выявлять ишемическую болезнь головного мозга. 11 з.п.ф-лы.

1. Набор реагентов для диагностики неврологических заболеваний, отличающийся тем, что содержит антиген из синтетического пептидного фрагмента фенциклидин-связывающего мембранного белка, иммобилизованный на твердом носителе, и реагент для определения присутствия аутоантител к фенциклидин-связывающему мембранному белку. 2. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит антиген, иммобилизованный на полимерном носителе. 3. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит антиген, иммобилизованный на полистироловом луночном носителе. 4. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит антиген, иммобилизованный на нитроцеллюлозе. 5. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит реагент для определения присутствия аутоантител, представляющий собой конъюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченный пероксидазой хрена. 6. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит субстрат для проведения пероксидазной реакции. 7. Набор по п. 1 или 6, отличающийся тем, что содержит 2,2'-азинобис (3-этилбензтиазолин-6-сульфоновую кислоту) и гидроперит. 8. Набор по п.1 или 3, отличающийся тем, что содержит детергент. 9. Набор по п.1 или 8, отличающийся тем, что содержит твин-20. 10. Набор по п. 1 или 3, отличающийся тем, что дополнительно содержит буферный раствор. 11. Набор по п.1 или 10, отличающийся тем, что содержит фосфатно-солевой буфер и/или цитратный буферные растворы. 12. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит поликлональные антитела к синтетическому фрагменту фенциклидинсвязывающего мембранного белка в качестве положительного контроля.