НАБОР "ПА-ТЕСТ" ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 C12Q1/04 A61K39/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к наборам реагентов для диагностики пароксизмальной активности и эпилепсии, и может найти применение в клинике нервных болезней.

Пароксизмальные состояния нервной системы относятся к нервным заболеваниям, которые широко распространены, особенно в развитых странах и имеют тенденцию к увеличению. Диагностика этих заболеваний производится, как правило, по данным тщательного клинического обследования пациентов, включающего применение электрофизиологических методов, ангиографии, рентгеноскопии, метода ядерного магнитного резонанса, позитронно-эмиссионной томографии и других инструментальных подходов. Для уточнения диагноза нередко используют клинико-биохимический анализ крови и других биологических жидкостей на содержание возбуждающих и тормозных нейромедиаторов и нейропептидов или продуктов их метаболизма: глютамата, ГАМК, серотонина, дофамина, моноаминооксидазы, эндорфина и др.[1].

Однако использование этих биохимических маркеров для оценки функционального состояния мозга и организма не позволяет однозначно определить степень вовлеченности определенных медиаторных и пептидергических систем в патогенез заболевания, что очень важно для определения тактики лечения, требует больших временных и экономических затрат на выполнение лабораторных анализов, не обладает достаточным уровнем специфичности для каждой нозологической формы, практически не дает возможность выявлять предрасположенность (группу риска), проводить диагностику нервно-психических заболеваний на ранних стадиях.

Известен реагент для диагностики эпилепсии на основе антигена из глутаматсвязывающего мембранного белка нервной ткани, являющийся наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению [2,3].

Известный реагент позволяет осуществить диагностику эпилепсии, однако не обладает достаточной специфичностью для разных нозологических форм нервно-психических заболеваний.

Задачей изобретения является разработка набора реагентов для диагностики неврологических заболеваний, позволяющего быстро и эффективно определять пароксизмальные состояния и эпилепсию, а также на ранних стадиях заболевания выявлять пациентов с предрасположенностью с этим заболеваниям.

Технический результат изобретения заключается в том, что предлагаемый набор "ПА-ТЕСТ" позволит быстро и качественно провести диагностику нервных заболеваний у значительного числа пациентов (до 200 человек) одновременно, высокоспецифичен, чувствителен и экономичен в использовании.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Диагностический набор "ПА-ТЕСТ" для диагностики неврологических заболеваний содержит антиген из квисквалат-связывающего мембранного белка нервной ткани, иммобилизированный на твердом носителе, и реагент для определения присутствия аутоантител к квисквалат-связывающему белку.

Набор предназначен для полуколичественного определения в сыворотке крови больных с пароксизмальной активностью содержания аутоантител к квисквалат-связывающему мембранному белку, выделенному из ткани головного мозга человека.

Квисквалат-связывающий мембранный белок (КМБ) является компонентом сложного рецептора белка мембран нейронов, нарушение функции которого приводит к патологическим изменениям в центральной нервной системе.

Увеличение уровня аутоантител к КМБ коррелирует с наличием и предрасположенностью к пароксизмальным состояниям и эпилепсии.

Сорбция КМБ на поверхность твердого носителя, например полистиролового 96-ти луночного планшета, позволяет избирательно извлекать аутоантитела из сыворотки крови. Образовавшийся комплекс "антиген-антитело" выявляется с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой. Уровень аутоантител к КМБ оценивают по изменению окраски субстратной смеси, регистрируемой с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм.

Набор "ПА-ТЕСТ" может дополнительно содержать субстрат для проведения пероксидазной реакции при связывании КМБ с аутоантителами к нему, например ортофенилендиамин, перекись водорода.

Набор может также содержать буферные растворы, например фосфатно-солевой и/или цитратный, для растворения лиофилизированных компонентов набора.

Набор может также содержать сыворотку пациентов с эпилепсией в качестве положительного контроля, сыворотку здоровых людей в качестве отрицательного контроля и чистый полистироловый планшет.

Набор может также содержать детергент, например твин-20.

Все компоненты набора являются нетоксичными, однако при работе с ортофенилендиамином следует избегать попадания на кожные покровы.

Набор "ПА-ТЕСТ" хранят при температуре не выше 8^oС. Компоненты набора, подготовленные к анализу, могут храниться при 2-8^oС в течение трех суток.

Для определения аутоантител к КМБ используют сыворотки крови, полученные стандартным образом. До проведения анализов возможно хранение образцов сывороток замороженными при минус 20^oС в течение одного месяца со дня взятия крови.

Пример 1. Подготовка реагентов для анализа. Растворяют лиофильно высушенный фосфатно-солевой буфер в дистиллированной воде - рабочий буфер (РБ). Смешивают РБ с твином-20 (РБ-Т).

Растворяют лиофилизированные контрольные сыворотки в РБ-Т.

Растворяют реагент для определения присутствия аутоантител-лиофилизированный конъюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченный пероксидазой хрома в РБ-Т. Растворяют лиофильно высушенный цитратный буфер в дистиллированной воде (ЦБ).

Раствор хромогена - ортофенилендиамина готовят непосредственно перед окраской.

Готовят разведения исследуемых сывороток 1:50 на РБ-Т.

Подготовленные растворы РБ, РБ-Т, ЦБ, контрольных сывороток, исследуемых сывороток и конъюгата хранят не более трех дней при 4^oС (в холодильнике). Раствор хромогена (субстратная смесь) готовят непосредственно перед использованием.

Проведение анализа. Извлекают планшет из упаковки и промывают РБ-Т.

В первые три лунки рядов 1-3 А₁, А₂ и А₃ планшета с КМБ и чистого планшета вносят по 0,1 мл РБ-Т. По этим лункам будет осуществляться контроль остановки реакции. В следующие три лунки В₁, В₂ и В₃ вносят по 0,1 мл раствора отрицательного контроля и далее в лунки С₁, С₂ и С₃ планшета - по 0,1 мл раствора положительного контроля.

В лунки оставшихся рядов вносят по 0,1 мл подготовленных, как описано выше, образцов испытуемых сывороток крови.

Планшет инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре. Отмывают планшет раствором РБ-Т и вносят по 0,1 мл раствора конъюгата в каждую лунку и снова инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре.

Готовят субстрактную смесь, для чего растворяют в ЦБ таблетки хромогена (ортофенилендиамин) и в образовавшийся раствор добавляют при тщательном перемешивании таблетку перекиси водорода.

Планшеты снова отмывают раствором РБ-Т, а затем дистиллированной водой.

Вносят по 0,1 мл субстратной смеси в каждую лунку планшета последовательно от первого к последнему ряду, защитив от попадания лучей прямого света.

Реакцию контролируют по пустым лункам до появления минимальной фоновой реакции (10-15 мин) и останавливают развитие окраски с помощью 50%-ной серной кислоты, добавляя по 0,03 мл в каждую лунку планшета. Фотометрируют при длине волны 492 нм, контролируя О-уровень по пустым лункам, или оценивают визуально по набору цветных бумажных индикаторов.

Оценка и интерпретация результатов. Значения оптических плотностей (ОП) в лунках с образцами усредняют по трем точкам. Вычисляют разность (А) между средней ОП каждого образца сыворотки и средней ОП на чистых лунках на планшете. Затем вычисляют отношение значения А для каждой сыворотки к значению А для отрицательной контрольной сыворотки и выражают в процентах.

Полученные результаты позволяют судить о принадлежности данного пациента к группе серопозитивных или серонегативных. Титр 120% и более означает серопозитивность данного пациента, менее 100% - серонегативность.

Корреляция результатов анализа и клинического состояния пациентов достигает 75-80%; т.е. в 75-80% случаев серопозитивность пациента свидетельствует о его принадлежности к группе риска.

Значения титра аутоантител в сыворотках крови пациентов хорошо коррелируют с выраженностью клинической картины заболевания.

В таблице приведены средние значения титра аутоантител для групп больных с различной выраженностью пароксизмальной судорожной активности.

Предлагаемый набор "ПА-ТЕСТ" позволит быстро и эффективно провести диагностику заболевания у значительного числа пациентов (до 200 человек) одновременно, а также позволит провести профилактические обследования больных групп населения с целью выявления группы риска по заболеванию.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Полетаев А.Б. и др. Исследование аутоиммунных процессов нервно-психических заболеваний с помощью количественного иммуноферментного анализа. // Иммунология, 1985, т.4, N 2, с.75-76.

2. Дамбинова С.А. и др. Фармакологическая характеристика, иммунохимическая идентификация и исследование локализации квисквалатных рецепторов головного мозга крысы и человека. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 1992, т.28, N 2, с.201-210.

3. WO, заявка, 93/00586, G 01 N 33/53, 07.01.93.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к наборам реагентов для диагностики пароксизмальной активности и эпилепсии, и может найти применение в клинике нервных болезней. Сущность изобретения: диагностический набор "ПА-ТЕСТ" для диагностики неврологических заболевании содержит антиген из квисквалат-связывающего мембранного белка нервной ткани, иммобилизированный на твердом носителе, и реагент для определения присутствия аутоантител к квисквалат-связывающему белку. Набор может дополнительно содержать субстрат для проведения пероксидазной реакции при связывании квисквалат-связывающего мембранного белка (КМБ) с аутоантителами к нему, буферные растворы, сыворотку здоровых людей в качестве отрицательного контроля, сыворотку пациентов с эпилепсией в качестве положительного контроля, детергент и чистый 96-ти луночный полистироловый планшет. В крови пациента определяют содержание аутоантител к КМБ. Иммунный комплекс детектируют по цветной пероксидазной реакции при связывании КМБ с ауто-антителами к нему с применением стандартного твердофазного иммуно-ферментного метода. Параллельно определяют содержание аутоантител к КМБ у здоровых лиц. Высокая концентрация аутоантител свидетельствует о предрасположенности и/или наличии у пациента пароксизмальной активности и/или эпилепсии. 12 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Набор для диагностики неврологических заболеваний, отличающийся тем, что содержит антиген из квисквалат-связывающего мембранного белка нервной ткани, иммобилизированный на твердом носителе, и реагент для определения присутствия аутоантител к квисквалат-связывающему белку. 2. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит антиген, иммобилизированный на полимерном носителе. 3. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит антиген, иммобилизированный на полистироловом луночном носителе. 4. Набор по п.1, отличающийся тем, что содержит реагент для определения присутствия аутоантител, представляющий собой конъюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченный пероксидазой хрена. 5. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит субстрат для проведения пероксидазной реакции. 6. Набор по пп.1 и 5, отличающийся тем, что содержит ортофетилендиамин и перекись водорода. 7. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит детергент. 8. Набор по пп.1 и 7, отличающийся тем, что содержит твин-20. 9. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит буферный раствор. 10. Набор по пп.1 и 9, отличающийся тем, что содержит фосфатно-солевой и/или цитратный буферные растворы. 11. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит сыворотку пациентов с эпилепсией в качестве положительного контроля. 12. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит сыворотку здоровых людей в качестве отрицательного контроля. 13. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит чистый полимерный луночный носитель.