ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОПИЙНОЙ НАРКОМАНИИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/52 

Настоящее изобретение относится к области медицины, а точнее к способу экспресс-диагностики опийной наркомании с использованием латексного диагностикума с иммобилизированным специфическим пептидным фрагментом.

Проблема наркомании является актуальной, и выявление наркозависимости экспресс-методом может значительно упростить диагностику и создать возможность для широкого скрининга населения.

Проявление злоупотребления наркотическими веществами часто не имеет специфических черт и может быть принято за проявление соматических или психических заболеваний, к тому же больные нередко скрывают употребление наркотиков (1). В настоящее время лабораторная диагностика наркомании основана на определении присутствия наркотического средства в организме: в волосах, крови и других биологических жидкостях. Наиболее используемыми тестами являются методы, основанные на иммунологическом и масс-спектроскопическом определении наркотиков в биологических тканях (2, 3).

Однако токсикологическая экспертиза биологических жидкостей свидетельствует только об однократном применении наркотического вещества, а определение наркотиков в волосах, свидетельствующее о хронической интоксикации, требует дорогостоящего оборудования.

Разработан метод диагностики опийной наркомании реакцией пассивной гемагглютинации с выявлением в сыворотке крови антител к морфину, повышенный уровень которых определяется у 50% больных опийной наркоманией и сохраняется повышенным в течение 2 месяцев после отмены наркотика (4).

У данного метода существуют следующие недостатки: неспецифичность за счет перекрестно реагирующих антигенов, находящихся на поверхности биологического носителя, в качестве которого выступают эритроциты; нестабильность при хранении эритроцитарного диагностикума.

Известен способ диагностики опийной наркомании методом иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на определении в сыворотке крови пациентов уровня аутоантител к опиатному рецептору, выделенному из мозга человека (5, 6). Установлено, что в процессах развития зависимости и толерантности к морфину и героину участвуют мю- и дельта-опиатные рецепторы. Предполагается, что опийная зависимость связана с увеличением числа опиатных рецепторов, участвующих в процессах положительного подкрепления в мозге. Установлено, что при хроническом введении опиатов изменяется баланс мю- и дельта-опиатных рецепторов в стриатуме, ядрах гипоталамуса и миндалине. Избыточный синтез и разрушение нейрорецепторов приводят к образованию иммуногенных фрагментов, которые, попадая в кровоток, вызывают развитие аутоиммунного ответа по типу антиген-антитело.

При использовании ИФА существует ряд сложностей, снижающих его чувствительность и специфичность, которые обусловлены стабильностью субстрата, качеством отмывки, специфичностью конъюгата, негомогенностью и эффектами краевых лунок планшета.

Также этот метод требует приборного обеспечения и определенных навыков работы. Использование белкового фрагмента в качестве антигена в ИФА представляет определенные трудности, в частности: выделение и очистка опиатного рецептора из мозга человека, стандартизация метода.

Наиболее близким к изобретению является способ определения опийной зависимости с помощью антигенов, где в качестве иммуногенных фрагментов нейрорецепторов мозга используются синтетические фрагменты мю- и дельта-опиатных рецепторов (7). ИФА аутоантител по этому способу основан на их связывании иммобилизированными синтетическими пептидными фрагментами опиатных рецепторов, нанесенными на ячейку полистиролового иммунологического планшета высокой сорбционной емкости "Biohit".

Анализ по этому способу не может быть широко использован, так как требует наличия дорогостоящих реагентов и многоканального спектрофотометра "Dinatech", что делает невозможным применять его в обычных лабораториях и больницах.

Целью данного изобретения является создание тест-системы, позволяющей осуществлять диагностику опийной наркомании, обладающей специфичностью, стабильностью и удобством применения.

Задача решена с помощью использования реакции латекс-агглютинации. Частицы полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм) сенсибилизировали синтетическими пептидными фрагментами опиатных рецепторов, что позволило создать тест-систему для выявления уровня специфических аутоантител с помощью реакции латекс агглютинации (РЛА), которая визуализирует связывание антиген-антитело в иммунологическом планшете.

Тест-система представляет собой иммуносорбент, где в качестве антигенной детерминанты была использована аминокислотная последовательность консервативного цитоплазматического участка, общего для мю- и дельта-опиатных рецепторов человека, длиной 23 аминокислоты, которая была рассчитана на основе индекса гидрофильности/гидрофобности, которая фиксирована ковалентной или ионной связью на иммуносорбенте, что обеспечивает сохранение иммуногенных свойств фрагмента (4). Наибольшая серологическая активность при использовании в качестве антигена синтетического фрагмента мю- и дельта-опиатных рецепторов наблюдалась при использовании полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм).

Заявляемая тест-система позволяет быстро и эффективно провести диагностику опийной наркомании. Кроме того, данный тест позволяет проводить профилактическое обследование населения с целью выявления лиц, употребляющих опиаты, что немаловажно для тестирования профессиональных групп (военных, операторов АЭС etc. ), работа которых связана с большой степенью ответственности.

Предложенный к применению специфический пептид был иммобилизирован на полистироловом латексе, использование которого в РЛА дало результаты, сопоставимые по своей чувствительности и специфичности с техникой ИФА. Заявляемая тест-система для выявления опийной наркомании является новой и в литературе не описана.

Метод РЛА легко выполним, обладает хорошей воспроизводимостью, чувствительностью и специфичностью.

Хотя в литературе агглютинационные латексные тест-системы с использованием в качестве действующего начала различных иммунореагентов известны, подбор латекса в каждом случае очень индивидуален. Белки, синтетические пептидные олигомеры, являющиеся антигенными детерминантами, благодаря своей структуре требуют определенных латексов, определенных условий проведения реакции, специфических рH, для того чтобы в качестве тест-системы обладать способностью адсорбировать антитела из биологических жидкостей. Изучая ряд латексов на основе полистирола, таких как сополимер полистирола с акролеином, полистирол с карбоксильными группами с диаметром около 0,84 мкм, а также латекс на основе сополимера полиметилметакрилата с карбоксильными группами с диаметром около 0,72 мкм, невозможно было получить специфическое связывание антител с синтетическим пептидным фрагментом мю- и дельта-опиатных рецепторов. В результате поиска латексов с различной сорбционной поверхностью с химическими группами для ковалентного привязывания антигена был найден латекс высокой сорбционной емкости и большого размера, подходящий для нанесения пептидного фрагмента. Ковалентное или ионное связывание пептида с функциональными группами приводило к увеличению специфичности анализа. Были изучены буферы боратный, фосфатный для получения латексных диагностикумов, и только фосфатный буфер рН 7,8 позволил получить эффективное связывание антигена, причем оптимальным количеством антигена для сенсибилизации является 0,1-10 мкг на 1 мл 1% латекса. В качестве основного критерия специфичности было использовано отношение выявленных титров аутоантител методом реакции латекс агглютинации между пулированными сыворотками здоровых доноров и лиц, страдающих опиатной наркоманией. Группа больных опийной наркоманией отличалась высокой частотой обнаружения повышенного уровня антител к опиатным рецепторам. Уровень антител в титре 1:16 и выше у больных опийной наркоманией регистрировался в 71,4%. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выявленных нами изменений уровня антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам у больных опийной наркоманией. Результаты титрования антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам по РЛА у больных опийной наркоманией сравнивали с данными, полученными по методу ИФА.

Пептидный фрагмент опиатсвязывающего мембранного белка, фиксированного на жестком иммуносорбенте, специфически выявляет в образцах крови больных опийной наркоманией и людей, входящих в группу риска по данному заболеванию, аутоантитела к опиатсвязывающему мембранному белку. Диагноз "опийная наркомания" ставится на основании 3-4-кратного превышения титра аутоантител в крови (>10,4 мкг/мл) по сравнению с контролем. Неспецифическая реакция тест-системы с образцами крови больных другими заболеваниями нервной системы не отмечена.

Заявляемая тест система была испытана на группе больных, страдающих опийной наркоманией, которая состояла из 21 человека. Контрольная группа состояла из 28 здоровых доноров, не употребляющих наркотических и седативных средств. Возраст обследованных составлял 16-35 лет. Пробы крови у больных опийной наркоманией отбирали в течение месяца после отмены наркотика. Сыворотки до анализа хранили при температуре -70^oС. Наличие в крови аутоантител к иммуногенному фрагменту опиатсвязывающего мембранного белка проверяли с помощью заявленной тест-системы (синтетическими пептидными фрагментами, соответствующими аминокислотным последовательностям опиатных рецепторов фиксированного на иммуносорбенте полистироловом латексе с карбоксильными группами), используя стандартную методику реакции агглютинации (РЛА). Эксперименты показали, что в сыворотке крови опийной наркоманией связывание антител опиатсвязывающим мембранным белком было повышено в сравнении с контрольной группой. Применение заявляемой тест-системы для диагностики опийной наркомании основано на обнаружении уровня антител к фрагменту мю- и дельта-опиатных рецепторов.

Таким образом, клинические исследования показали связь между уровнем аутоантител (УАА) к пептидному фрагменту опиатного и степенью выраженности опийной зависимости.

Наибольшая серологическая активность при использовании в качестве антигена синтетического фрагмента мю- и дельта-опиатных рецепторов наблюдалась при ковалентном связывании с частицами полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм).

Величины антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам в группах больных опийной наркоманией, эпилепсией и здоровых доноров, выявленные методом РЛА представлены в табл.1. Повышенными считали уровень антител в количестве 10,4 мкг/мл и более, который не наблюдался в сыворотках здоровых людей. Группа больных опийной наркоманией отличалась высокой частотой обнаружения повышенного уровня антител к опиатным рецепторам. Уровень антител в количестве 10,4 мкг/мл и выше у больных опийной наркоманией регистрировался в 71,4%. Среднее количество специфических аутоантител в группе больных опийной наркоманией составило 9,91±0,36 мкг/мл, что достоверно в 2,8 раз выше по сравнению с уровнем антител у здоровых доноров. Отмечено, что частота выявления специфических аутоантител в количестве 10,4 мкг/мл и выше была повышена у больных опийной наркоманией. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выявленных нами изменений уровня антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам у больных опийной наркоманией.

Уровень антител к мю- и дельта-опиатным рецепторам у больных опийной наркоманией также был определен методом ИФА. Сравнительные данные по методу ИФА и РЛА представлены в табл.2. Показано повышенное содержание антител у 71,4% больных. Установлена достоверно корреляция между уровнями антител у больных опийной наркоманией, измеренными с помощью РЛА и ИФА (r=0,77; р<0,05). У наркоманов с повышенным уровнем антител, выявленным РЛА, результаты не всегда подтверждались ИФА. Наблюдаемые различия могут быть связаны с тем, что в ИФА измерялось содержание иммуноглобулина G к исследуемым антигенам, а в РЛА определялись антитела и других основных изотипов М и А. Таким образом, в проведенном нами сравнительном исследовании методами ИФА и РЛА были установлены достоверные различия содержания антител у больных опийной наркоманией и здоровых доноров, что может свидетельствовать об индукции антител к опиатному рецептору при хронической опийной интоксикации. Антитела к опиатным рецепторам в крови людей, употребляющих наркотики, служат важным диагностическим признаком и позволяют осуществить быстрый анализ образцов крови у значительного (до 200 человек) количества больных одновременно. Это дает возможность быстро и эффективно проводить диагностику опийной наркомании. Применение заявляемой тест-системы позволит расширить методы текущего контроля за состоянием больного и, тем самым, оптимизировать процесс лечения.

Заявляемую тест-систему получают по следующей методике/
Иммобилизацию синтетического пептидного фрагмента на частицы латекса осуществляют так. Перед сенсибилизацией частицы латекса отмывают два раза фосфатным буфером рН 8,0, доводят до концентрации 1% и смешивают с антигеном. Сенсибилизирующая доза антигена составляет 0,1-10 мкг на 1 мл латекса. Смесь инкубируют 1,5 ч при 37^oС, частицы отмывают фосфатным буфером и инкубируют в глициновом буфере рН 7,8 еще в течение 1 ч для инактивации оставшихся свободными функциональных групп. Затем частицы латекса переводят в фосфатный буфер. Рабочая концентрация латекса для реакции в планшетах составляет 0,05%. Чувствительность латексного диагностикума оценивают в РЛА.

При изучении чувствительности латексного диагностикума с различными антигенами выявляют конечный титр антител со стандартной сывороткой в зависимости от видов латекса. РЛА ставят микрометодом в полистироловых планшетах для иммунологических реакций с U-образным дном. Сыворотки добавляют в объеме 75 мкл в первую лунку каждого ряда, а затем раститровывают с двухкратным шагом разведении в 75 мкл изотонического раствора NaCl. В каждую лунку добавляют по 75 мкл латексного диагностикума. Реакцию учитывают визуально через 16-20 ч по 4-крестовой системе. За титр сыворотки принимают максимальное ее разведение, при котором наблюдается агглютинация латекса на "4+". При титровании сывороток с контрольным латексом наблюдают полное отсутствие агглютинации латекса.

Количественное определение связавшихся с латексом антител проводили при помощи построения соответствующей калибровки. Реакция латекс агглютинации (использованы частицы полистирола с активными карбоксильными группами диаметром 0,99-1,05 мкм) наблюдалась при минимальной концентрации специфических антител (IgA + IgG + IgM), равной 2,6 мкг/мл. Данная цифра была получена путем вычитания количества неспецифически связавшихся антител с несенсибилизированным пептидом латексом от общего количества связавшихся антител с сенсибилизированным латексом. Связавшиеся антитела смывают раствором 3М NaCl. Содержание белка в элюенте определяют по стандартному методу Лоури. Концентрацию белка определяют, используя калибровочную кривую, построенную для стандартного белка в диапазоне от 1 μg/ml до 1500 μg/ml. Оптическую плотность измеряют при длине волны 750 нм. Таким образом, полученная калибровка позволяет количественно оценивать результаты РЛА путем умножения приведенного коэффициента на максимальный титр разведения сыворотки, при котором наблюдается реакция латекс агглютинации.

Для оценки связи между показателями использовали коэффициент корреляции Пирсона, статистическую достоверность межгрупповых различий вычисляли по t-критерию Стьюдента.

Пример выполнения экспресс-диагностики опийной наркозависимости. Для проведения опыта была приготовлена тест-система. Полистирол с активными карбоксильными группами диаметром 1,0 мкм отмывали 2 раза фосфатным буфером рН 8,0, после чего приготовили его 1% раствор и смешали с антигеном так, чтобы на 1 мл латекса приходилось 0,2 мкг антигена. После инкубации при 37^oС в течение 1,5 ч частицы отмывали фосфатным буфером и снова инкубировали в течение 1 ч в глициновом буфере рН 7,8. Частицы латекса с антигеном перенесли в фосфатный буфер, их концентрация в нем составляет 1%. Для определения уровня антител в крови наркозависимых (опийная наркомания) были приготовлены сыворотки 10 больных. Анализ проводили в полистироловых планшетах для иммунологических реакций с U-образным дном. Сыворотки добавили в объеме 75 мкл в первую лунку каждого ряда, а затем раститровывали с двухкратным шагом разведений в 75 мкл изотонического раствора NaCl. В каждую лунку добавили по 75 мкл латексного диагностикума. Реакцию учитывали визуально через 16-20 ч по 4-крестовой системе. За титр сыворотки принимали максимальное ее разведение, при котором наблюдали агглютинацию латекса на "4+". При титровании сывороток с контрольным латексом наблюдали полное отсутствие агглютинации латекса. У всех 10 пациентов с опийной наркоманией отмечено наличие повышенного уровня антител. Величина титра антител к опиатным рецепторам составляет приблизительно 10,4 мкг/мл и выше.

Проверка сыворотки крови 10 здоровых людей при постановке РЛА в таком же иммунологическом планшете выявило наличие антител в количестве, менее и равном 3,33 мкг/мл.

Заявляемая тест-система позволяет достоверно определять опийную наркоманию и выявлять группу риска. Она может быть широко использована в медицинской практике благодаря тому что не требует специального оборудования и результаты анализа определяются визуально.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Пятницкая И.Н. (1994) Наркомании. М., 544 с.

2. Pichini S., Pacifici R., Altieri I., Pellegrini M., Zuccaro P. (1999) J. Anal Toxicol., 23, 343-348.

3. Eldefrawi M. E. , Azer N.L., Nath N., Anis N.A., Bangalore M.S.,; O'Connell K. P. , Schwartz R.P., Wright J. (2000) Appi Biochem Biotechnol, 87(1), 25-35.

4. Гамалея Н.Б. (1994) Вопросы наркологии, 2, 47-53.

5. Изыкенова Г. А., Сиренко В.В., Дамбинова С.А. (1995) Вопросы наркологии. 1, 45-49.

6. Дамбинова С. А. , Изыкенова Г.А. (1997) Журнал высшей нервной деятельности, 42(2), 1551-1556.

7. Izykenova G.A., Smith J.E. (2000) Identification of autoantibodies to peptide candidate for opiate receptors in peripheral fluids and brain. Abstr. of CPDD Meeting, Puerto-Rico, June 2000, S238C.

Изобретение относится к области медицины. Тест-система для выявления опийной наркомании и группы риска представляет собой аминокислотную последовательность консервативного цитоплазмического участка, общего для мю- и дельта-опиатных рецепторов человека, длиной 23 аминокислоты, фиксированной ковалентной или ионной связью на носителе - частицах полистирола с карбоксильными группами (диаметр 0,99-1,05 мкм), обеспечивающая сохранение иммуногенных свойств фрагмента. Использование данной тест-системы для диагностики позволяет количественно определять уровень аутоантител к опиатным рецепторам, величина которых согласно данным клинических исследований коррелирует с продолжительностью и тяжестью опиатной зависимости, что позволяет сделать заключение об опиатной наркозависимости. 2 табл.

Тест-система для выявления опийной наркомании, представляющая собой иммуносорбент, включающий в качестве антигенной детерминанты синтетический пептид, аминокислотная последовательность которого представлена консервативным цитоплазматическим участком, гомологичным для мю- и дельта-опиатных рецепторов человека длиной 23 а. о. , ковалентно или ионно связанной с носителем, отличающаяся тем, что в качестве носителя использован полистирол с активными карбоксильными группами диаметром 0,99-1,05 мкм, причем сенсибилизирующая доза антигена составляет 0,1-10 мкг на 1 мл 1%-ного латекса.