СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/68 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики неврологических заболеваний, и может найти широкое применение в нейрореанимационных, неврологических и реабилитационных отделениях стационаров, в амбулаторных условиях - для проведения диспансерного наблюдения за больными с сосудистыми заболеваниями головного мозга (группа риска по развитию церебрального инсульта).

Проблема острой церебральной ишемии сохраняет чрезвычайную актуальность в современной неврологии. Наиболее грозным ее проявлением является развитие ишемического инсульта (инфаркта мозга), когда потенциально обратимые изменения биохимических процессов, функционального состояния головного мозга трансформируются в стойкий очаговый морфологический дефект. Исследования последних лет значительно углубили представления о метаболических аспектах патогенеза ишемического инсульта. Было установлено, что острое развитие церебральной ишемии (снижение поступления в ткань мозга энергетических субстратов) запускает каскад патобиохимических реакций, конечным результатом которых является гибель нервной ткани. Одним из начальных звеньев патобиохимического "каскада" является дестабилизация клеточных мембран и встроенных в них рецепторов. Доказано, что ведущую роль в развитии патологического процесса играют изменения со стороны аминацидергической медиации и, прежде всего, глутаматовых рецепторов (особенно NMDA-типа). Избыточное высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров (глутамата и аспартата) представляет собой ключевой момент патогенеза и обусловливает запуск конечных патобиохимических реакций, ведущих к деструкции нервных клеток (теория "эксайтотоксичности") (B.K.Siesjo, F.Bengtsson, 1985, 1989, D.W.Choi, 1988, B.Meldrum et al, 1989, M.Ginsberg, 1990).

Широкая распространенность сосудистых заболеваний головного мозга, высокие показатели смертности (II место после заболеваний сердца) и инвалидизации (более 80%) после перенесенного инсульта настоятельно требуют разработки проблемы ранней диагностики острой церебральной ишемии и своевременной ее коррекции.

В настоящее время в клинике отсутствуют методы, способные быстро и эффективно выявить острую церебральную ишемию, оценить ее выраженность и возможность трансформации в инфаркт мозга. Возрастные и индивидуальные различия в реакциях ткани мозга на дефицит энергетических субстратов не позволяют использовать для диагностики острой церебральной ишемии концентрации кислорода, глюкозы и ее метаболитов.

Применяемые в экспериментальных исследованиях методы определения концентрации нейротрансмиттерных аминокислот (путем высокоэффективного жидкостного электрофореза с биохимической детекцией) в клинических условиях имеют существенные недостатки: сложны и длительны в исполнении, эффективны лишь в спинномозговой жидкости (требуют проведения люмбальной пункции), а кроме того, выявляемые изменения в составе аминокислот неспецифичны и не позволяют однозначно судить о специфических ишемических нарушениях в ткани мозга.

Заявляемый способ диагностики острой церебральной ишемии является новым и в литературе не описан.

Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что диагностика острой церебральной ишемии проводится путем сравнительного определения в крови пациента аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку.

Проводят анализ 20 микролитров крови, взятой у пациента из вены или из пальца с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного метода. По методике С.А.Дамбиновой определяют в крови содержание аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку (компоненту глутаматовых NMDA-рецепторов головного мозга) путем связывания на твердофазной синтетической матрице при разведении сыворотки 1:50, продолжительности инкубации реагентов 1 час при температуре 20-25 градусов по Цельсию. Иммунный комплекс детектируют по цветной пероксидазной реакции при связывании фенциклидинсвязывающего мембранного белка с аутоантителами к нему.

Выделенный и очищенный фенциклидинсвязывающий мембранный белок наносится на полистироловый микропланшет для иммунологических исследований и инкубируется в течение 14-16 часов при температуре 4 градуса по Цельсию. В ходе испытаний образцы сыворотки крови пациентов и здоровых лиц наносили в лунки микропланшетов. В качестве положительного контроля служила кроличья антисыворотка к фенциклидинсвязывающему мембранному белку, наносимая в лунки планшета параллельно с исследуемыми образцами в концентрации от 0,1 до 400 нг/мл по белку. Базовый ("нулевой") уровень отсчета выбирался по данным анализа образцов донорской сыворотки, истощенной на суммарном мембранном препарате, выделенном из головного мозга крыс. После нанесения образцов планшеты инкубировали 1 час при температуре 20-25 градусов по Цельсию и уровень связывания с иммуногенным фрагментом фенциклидинсвязывающего мембранного белка определяли по стандартной методике твердофазного иммуноферментного анализа, используя конъюгированный с пероксидазой из корня хрена белок A. Отсчет результатов производили с помощью многоканального спектрофотометра Multiscan (Швеция) по величине поглощения растворов (E-492) при длине волны 492 нм. Строили калибровочную кривую для положительного контроля, откладывая по оси абсцисс концентрацию антител, по оси ординат - величину E-492. Концентрацию аутоантител в пробах определяли по калибровочной кривой, на основании величины E-492.

Содержание аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в крови здоровых лиц было 0,3-1,5 нг/мл. Содержание аутоантител свыше 1,5 нг/мл было обнаружено в крови больных с острой церебральной ишемией (в острейшем периоде церебрального ишемического инсульта).

Сыворотка крови исследовалась у 50 больных в острейшем периоде церебрального ишемического инсульта - через 3, 6, 9, 12, 24 часа с момента развития заболевания, на 3 и 5 сутки. У всех больных определялось повышение титра аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку, особенно выраженное в течение первых 12 часов с момента развития инсульта. Средние показатели титра составили: в первые 3 часа - (5,65+0,85) нг/мл, в 6 часов - (5,67+1,10) нг/мл, в 9 часов - (3,74+1,25) нг/мл, в 12 часов - (7,08+2,05) нг/мл. Повышение уровня титра аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в сыворотке крови свидетельствует о проявлении иммунной реакции организма в ответ на нарушения обмена белковых компонентов глутаматовых рецепторов, что характерно для самых ранних стадий острой церебральной ишемии. К конца 1 суток инсульта отчетливо проявлялась тенденция к нормализации уровня титра аутоантител - (2,16+0,55) нг/мл. Однако выраженность нормализации уровня титра была различна у разных больных, тесно коррелировала с функциональным состоянием головного мозга, по данным полимодального нейрофизиологического мониторирования (мониторирование ЭЭГ, топоселективных картограмм ЭЭГ, исследование соматосенсорных и стволовых вызванных потенциалов мозга, транскраниальная кортикальная магнитная стимуляция, электронейромиография), и позволяла прогнозировать дальнейшее течение заболевания. Средние показатели титра аутоантител оставались повышенными на 3 сутки инсульта (2,60+0,35 нг/мл) и, в меньшей степени на 5 сутки (1,92+0,65 нг/мл). Вместе с тем, у больных с регредиентным течением заболевания на 5 сутки заболевания титр аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку соответствовал контрольным значениям.

Таким образом, уровень титра аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку отражает выраженность ишемии мозговой ткани. Нормализация концентрации аутоантител опережает положительную клиническую динамику. При снижении концентрации аутоантител до контрольного уровня к концу 1 суток инсульта можно прогнозировать наиболее благоприятное, регредиентное течение заболевания.

Пример 1. Больной П., 49 лет, N и.б. 15739, поступил в нейрореанимационное отделение 13.05.1994 г. через 5 часов с момента развития ишемического инсульта в правом полушарии головного мозга (острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в системе правой внутренней сонной артерии) на фоне гипертонической болезни III стадии.

При поступлении в клинику - состояние средней тяжести, снижение пульсации на правой сонной артерии, частота сердечных сокращений (ЧСС) - 80 в 1 мин. , АД - 180/100 мм рт.ст., расширение границ сердца влево на 2 см. Оглушен, сонлив, быстро истощаем. Парез взора влево. Центральный парез мимических мышц и языка слева. Парез конвергенции. Рефлексы орального автоматизма. Левосторонний гемипарез со снижением мышечной силы в руке до 3,5 баллов, в ноге - до 3 баллов, с низким мышечным тонусом в паретичных конечностях, снижением глубоких рефлексов и появлением патологических пирамидных рефлексов слева. Левосторонняя гемигипестезия. Суммарный клинический балл (по унифицированной шкале неврологического дефицита - Е.И.Гусев, В.И.Скворцова, 1989) при поступлении составил 39. Клинические и биохимические исследования крови, мочи, ликвора - без изменений. Исследование титра аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в сыворотке крови выявило его повышение: через 6 часов с момента развития инсульта - 6,9 нг/мл, через 9 часов - 5,7 нг/мл, через 12 часов - 4,4 нг/мл, что отражало выраженность ишемических изменений в ткани мозга.

Больному проводилась дифференцированная интенсивная терапия, включающая гемодилюцию, назначение антиагрегантных препаратов, антиоксидантов, противоотечных средств.

К концу 1 суток заболевания титр аутоантител снизился до 1,7 нг/мл, что свидетельствовало об уменьшении выраженности церебральной ишемии и позволяло прогнозировать благоприятное течение заболевания.

Действительно, к 5 суткам инсульта состояние больного улучшилось: ясное сознание, активен. Полностью регрессировали парез взора, центральный парез мимической мускулатуры и языка, гемигипестезия. Уменьшилась выраженность левостороннего гемипареза до 4-4,5 баллов. Суммарный клинический балл составил 45, т. е. нарос на 6 баллов. Показатели уровня антител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку не отличались от контрольных значений при исследовании на 3 сутки (1,5 нг/мл) и 5 сутки (1,4 нг/мл) заболевания. К концу острого периода инсульта (21 день) у больного полностью регрессировала неврологическая симптоматика - вариант "малого" инсульта.

Пример 2. Больная С., 65 лет, N и.б. 12147, поступила в нейрореанимационное отделение 7.05.94. через 4 часа после развития ишемического инсульта в левом полушарии головного мозга (острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в системе левой внутренней сонной артерии) на фоне атеросклероза сосудов мозга и сердца, гипертонической болезни III стадии, ИБС, стенокардии напряжения.

При поступлении в клинику - состояние тяжелое. Асимметрия пульсации на сонных артериях, s < d. Тоны сердца глухие, ритмичные, 84 в 1 мин. АД - 150/90 мм рт. ст. Контакт с больной затруднен из-за выраженных афатических расстройств. Жестами указывает на головную боль в височных областях. Локальные менингеальные симптомы: скуловой симптом Бехтерева слева, симптом Кернига, s > d. Центральный парез мимической мускулатуры и языка справа. Глубокий правосторонний гемипарез со снижением мышечной силы в конечностях до 1-2 баллов. Снижение мышечного тонуса и сухожильных рефлексов в паретичных конечностях. Односторонние пирамидные рефлексы справа. Моторная афазия. Суммарный клинический балл на момент поступления в клинику составил 34 балла. Клинические и биохимические анализы крови, мочи, ликвора - без изменений. ЭКГ - признаки гипертрофии левого желудочка. Исследование титра аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку выявило выраженное его увеличение: через 6 часов с момента развития инсульта - 4,5 нг/мл, через 9 часов - 8,0 нг/мл, через 12 часов - 14,0 нг/мл.

Больной проводилась дифференцированная интенсивная терапия, направленная на улучшение центральной и церебральной гемодинамики, профилактику нарастания внутричерепного давления и отека мозга, коррекцию гомеостаза.

К концу 1 суток инсульта титр аутоантител оставался высоким - 6,2 нг/мл, чему соответствовало отсутствие в клинической картине положительной динамики на протяжении всего острейшего периода заболевания (до 5 суток).

К концу острого периода инсульта (21 день) - состояние больной средней тяжести, сохраняется выраженный очаговый дефект: центральный парез мимической мускулатуры справа, правосторонний гемипарез со снижением мышечной силы до 3 баллов, моторная афазия. Суммарный клинический балл составил 37, что соответствовало тяжелой инвалидизации больной.

Таким образом, длительное сохранение высокой концентрации аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в сыворотке крови отражает стойкость ишемических нарушений в церебральной ткани, имеет неблагоприятное прогностическое значение для дальнейшего течения инсульта и восстановления нарушенных неврологических функций.

Пример 3. Больной Ш., 67 лет, N и.б. 14251, поступил в нейрореанимационное отделение 29.05.94. через 7 часов с момента развития ишемического инсульта в левом полушарии головного мозга (острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в системе левой внутренней сонной артерии) на фоне атеросклероза сосудов мозга и сердца, гипертонической болезни III стадии, сахарного диабета II типа, ИБС, стенокардии напряжения, постинфарктного кардиосклероза.

При поступлении - состояние больного крайне тяжелое. Кожные покровы бледные, влажные. Сердечные тоны глухие, ритмичные, 120 в 1 мин. АД - 210/110 мм рт.св. Сознание изменено до уровня сопора. Двигательная реакция целенаправленная при болевых раздражителях. На боль открывает глаза, стонет. Локальные оболочечные симптомы: скуловой симптом Бехтерева слева, двусторонний симптом Кернига. Парез взора вправо. Центральный парез мимической мускулатуры справа. Рефлексы орального автоматизма. Правосторонняя гемиплегия с меняющимся мышечным тонусом. Периодические горметонии. Трофические нарушения на коже крестца. Суммарный клинический балл на момент поступления в клинику составил 25.

Клинический анализ крови: умеренный лейкоцитоз, ускорение СОЭ. Глюкоза крови - 8,4 ммоль/л, мочевина крови - 8,4 ммоль/л. Клинический анализ мочи без патологии. Спинномозговая жидкость выделялась под высоким давлением, не изменена. ЭКГ - левограмма, рубцовые изменения в передне-боковых отделах миокарда левого желудочка. Титр аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку в сыворотке крови через 9 часов после развития инсульта - 49,0 нг/мл, через 12 часов - 44,0 нг/мл. Резкое повышение концентрации аутоантител отражало высокую степень ишемических изменений в ткани головного мозга, крайнюю тяжесть состояния больного.

К концу первых суток состояние больного оставалось тяжелым, сохранялись признаки отека мозга, очаговый дефект не проявлял тенденции к регрессу. Титр аутоантител оставался высоким - 40,0 нг/мл.

На 3 и 5 сутки заболевания концентрация аутоантител в сыворотке крови несколько снизилась, но по-прежнему значительно превышала контроль (соответственно: 16,0 и 17,0 нг/мл). На фоне комплексной интенсивной терапии состояние больного к 5 суткам инсульта стабилизировалось: АД - 170/100 мм рт.ст. Ps - 76 в 1 мин. Ясное сознание, оболочечных симптомов нет, умеренный парез взора вправо, центральный парез мимической мускулатуры справа, правосторонний гемипарез со снижением мышечной силы в руке до 2,5-3 баллов, до плегии в ноге. Грубая моторная афазия с неполным пониманием речи. Суммарный клинический балл - 30 (нарос на 5 баллов).

К концу острого периода инсульта (21 сутки) состояние больного средней тяжести, сохраняется грубый очаговый дефект. Суммарный клинический балл - 30, что отражает тяжелую инвалидизацию больного.

Таким образом, предлагаемый способ определения аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку нервной ткани в крови пациентов является высокоспецифичным для острой церебральной ишемии, позволяет тонко оценивать динамику состояния больных в острейшем периоде ишемического инсульта, прогнозировать течение инсульта и возможности восстановления нарушенных неврологических функций; в амбулаторных условиях позволяет проводить эффективный контроль за состоянием больных с хронической церебральной сосудистой недостаточностью с целью выявления группы риска по развитию церебрального инсульта и своевременного назначения превентивных лечебных мероприятий (профилактическое направление).

Заявляемый способ диагностики может быть использован в медицинской практике для диагностики острой церебральной ишемии, определения риска возникновения церебрального ишемического инсульта, слежения за состоянием больных в первые часы и дни ишемического инсульта с уточнением прогноза заболевания.

Заявляемый способ диагностики позволяет быстро и эффективно провести диагностику острой церебральной ишемии у значительного числа пациентов (до 200 человек) одновременно, что делает возможным использование его для профилактического обследования больших групп населения с целью выявления группы риска по развитию церебрального ишемического инсульта и своевременного проведения превентивных лечебных мероприятий.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике неврологических заболеваний. Сущность изобретения: в крови пациента определяют содержание аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку нервной ткани. Иммунный комплекс детектируется по цветной пероксидазной реакции при связывании фенциклидинсвязывающего мембранного белка с аутоантителами к нему с применением стандартного твердофазного иммуноферментного метода. Параллельно определяют содержание аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку у здоровых лиц. Высокая концентрация аутоантител (более 1,5 нг/мл) свидетельствует о наличии у больного острой ишемизации ткани головного мозга. Изобретение позволяет объективизировать диагноз острой ишемии ткани головного мозга, определить риск возникновения церебрального инсульта.

Способ выявления острой церебральной ишемии путем исследования биологической жидкости, отличающийся тем, что в крови определяют содержание аутоантител к фенциклидинсвязывающему мембранному белку нервной ткани и при уровне его более 1 нг/мл диагностируют острую церебральную ишемию.