РЕПОРТЕР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОМОТОРОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N15/00 C12N15/52 C12N15/63 C12N1/21 

Настоящее изобретение относится к области биологии, в частности молекулярной биологии и генетической инженерии, и может быть использовано для медико-биологических исследований и клинической диагностики.

В настоящее время известно несколько репортерных генов, однако все они имеют недостатки.

Бета-галактозидаза кодируется геном lacZ и обычно используется в системах Escherichia coli в делетированном виде на основе альфа-комплементации (Cronan JE Jr, Narasimhan ML, Rawlings M. Insertional restoration of beta-galactosidase alpha-complementation (white-to-blue colony screening) facilitates assembly of synthetic genes. Gene 1988, 70(1) : 161-170). Полноразмерный ген lacZ имеет большой размер, а его белковый продукт непригоден для исследования промоторов генов белков теплового цикла, поскольку при высоких температурах он теряет стабильность и активность.

Бактериальная люцифераза кодируется опероном luxAB и состоит из двух субъедииниц и также нестабильна при повышенных температурах (Shen H, Gold SE, Tamaki SJ, Keen NT. Construction of a Tn7-lux system for gene expression studies in gram-negative bacteria. Gene 1992, 122(1): 27-34). Для тестирования активности люциферазы необходимо дорогостоящее оборудование - флуориметр или цифровая видеокамера с амплификатором светового сигнала.

Бета-глюкоронидаза, CUS, используется для исследования экспрессии генов в растениях (Hull GA, Devic M. The beta-glucuronidase (gus) reporter gene system. Gene fusions; spectrophotometric, fluorometric, and histochemical detection. Methods Mol Biol 1995; 49: 125-141). Белок нестабилен при высоких температурах и требует для анализа флуорометрическое оборудование.

Зеленый флуоресцентный белок, GFP, также нестабилен при высоких температурах, а для анализа его экспрессии требуется цифровая видеокамера или флуоресцентный микроскоп (Poppеnborg, Friehs K, Flaschel E. The green fluorescent protein is a versatile reporter for bioprocеss monitoring. J. Biotechnol 1997, 58(2):79-88).

Цель изобретения - получение вектора, в котором в качестве репортера используется ген, продукт которого должен быть стабилен и активен в широком интервале температур, от 20 до 80^oC, и экспрессия которого фиксируется простым и дешевым способом.

Поставленная цель достигается тем, что использован ген 1,3-1,4-β-глюканазы (лихеназы), полученный из супертермофильной бактерии Clostridium thermocellum, в качестве репортера для исследования промоторов.

Суть изобретения состоит в том, что в качестве репортера используется ген LicB, кодирующий фермент лихеназу из Clostridium thermocellum. Ген licB позволяет делетирование с обеих концов без потери ферментативной активности. В качестве репортера использован укороченный ген лихеназы размером 800 пар оснований, кодирующий белок размером около 28 кДа. Лихеназа использует в качестве субстрата лихенан - дешевый водорастворимый 1,3-1,4-β-глюкан, производимый различными компаниями во всем мире. Предлагаемый вектор, pLicB-Km, несет ген licB без промотора, поэтому клоны бактерий, трансформированные таким вектором, не способны расщеплять субстат. Клонирование промотора заставляет экспрессировать ген licB и позволяет нарабатывать лихеназу, которая расщепляет лихенан. Последующая окраска колоний красителем Конго красным позволяет селектировать клоны, в которых присутствуют промоторы, направляющие экспрессию лихеназы, поскольку краситель связывается с лихенаном и не связывается с продуктами его гидролиза.

В результате на темно-красном фоне можно наблюдать бесцветные пятна, соответствующие колонам, имеющим активный ген licB.

Изобретение имеет "изобретательский шаг", так как впервые предлагает использование гена, кодирующего термостабильный фермент лихеназу в качестве репортера. Применение гена licB в качестве репортера предполагает инкубацию клонов, несущих этот ген, или белков, разделенных электрофорезом при 70 - 80^oC. При таких температурах белки мезофильных организмов денатурируют, что позволяет избавиться от фоновой неспецифической активности любых других белков, которые могли бы помешать четкой детекции репортерного белка. В то же время температура 70 - 80^oC является оптимальной для активности самой лихеназы. Использование лихеназы в качестве репортера позволяет определять активность исследуемых промоторов с высокой эффективностью и надежностью.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

1. Сконструирован вектор pLicB-Km для клонирования промоторов с использованием гена лихеназы в качестве репортера и несущий гены устойчивости к канамицину и ампициллину (фиг. 1). В качестве контрольных промоторов использовали промотор генов белков теплового шока groE, cpn60 и hsp17 из мезофильной цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и промотор гена desC, кодирующего десатуразу жирных кислот в термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus. Промоторы вместе с инициирующими кодонами АТГ были получены из геномных ДНК соответствующих организмов с помощью полимеразной цепной реакции. Праймеры для проведения полимеразной цепной реакции были синтезированы так, что каждый из амплифицированных фрагментов имел на концах уникальные сайты рестрикции BamH I и EcoR I, необходимые для клонирования в аналогичные уникальные сайты вектора pLicB-Km. Амплифицированные фрагменты были клонированы в вектор pLicB-Km по указанным сайтам так, чтобы была сохранена рамка считывания гена licB.

Полученные плазмиды были трансформированы в клетки E.coli XL-1 Blue MRF' и клоны трансформантов были отобраны на агаризированной среде LB, содержащей ампициллин и канамицин.

2. Активность промоторов определялась следующим методом: колонии бактерий, трансформированные соответствующими плазмидами, высевались на чашки амплификатором и подращивались в течение 12 часов при 37^oC. Затем колонии были покрыты слоем поверхностного агента, содержащим субстрат для лихеназы, лихенан (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,7% агароза, 0,5% лихенан). Чашки переносили в инкубатор с температурой 65^oC на 1 час, чтобы обеспечить оптимальную температуру для активности лихеназы. Затем чашки красили раствором Конго красного (0,5% раствор в 50 мМ Трис-Hcl, pH 8,0) в течение 10 мин при комнатной температуре с постоянным покачиванием. Несвязавшийся с лихенаном краситель отмывали раствором 1 М NaCl в воде при комнатной температуре в течение 1 часа. Результаты эксперимента представлены на фиг. 2. Клоны, содержащие вектор pLicB-Km без промоторов, окрашены в темно-красный цвет. Клоны, содержащие вектор pLicB-Km с промоторами, образуют бесцветные прозрачные пятна.

3. Активация промоторов генов белков теплового шока высокой температурой тестировалась следующим образом. Клоны E. coli, несущие pLicB-Km с промотором оперона groE, выращивали в жидкой среде при 30^oC до оптической плотности 0,5 при 560 нм. На этой стадии отбирали 1 мл клеток для контрольного анализа. Затем клетки переносили на 45^oC и продолжали инкубацию в течение 1 часа. Для анализа отбирали 1 мл культуры. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,2 мкл воды и лизировали в течение 40 мин при 70^oC в однократном стандартном буфере для проведения электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS - ПААГ). Белки разделяли электрофорезом в 15% полиакриламидном геле, содержащем SDS и 0,5% лихенан, в течение 3 часов при постоянной силе тока в 22 мА. Для разделения использовался стандартный трипс-глициновый буфер. После электрофореза гель дважды промывался в 50% этаноле и 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 для удаления SDS, ингибирующего активность лихеназы. После отмывки гель помещали в 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и инкубировали при 65^oC в течение 1 часа. Гель окрашивали в 0,5% растворе Конго красного в воде в течение 10 мин и отмывали в 1 М NaCl в течение 30 мин при комнатной температуре. На темно-красном фоне появлялись прозрачные полосы, соответствующие положению в геле и активности лихеназы (фиг. 3).

В результате изобретения получен вектор, несущий ген licB, кодирующий лихеназу, который служит в качестве репортера для исследования активности промоторов разного типа. Термостабильность лихеназы позволяет детектировать активность этого белка простым, дешевым и эффективным способом.

Настоящее изобретение относится к области биологии, в частности молекулярной биологии и генетической инженерии, и может быть использовано для медико-биологических исследований и клинической диагностики. Предложен ген licB, кодирующий лихеназу (1,3-1,4-β-глюканазу), который служит в качестве репортера для исследования активности промоторов разного типа. Термостабильность лихеназы позволяет детектировать активность этого белка простым, дешевым и эффективным способом. 3 ил.

Применение гена lic В, кодирующего 1,3-1,4-β-глюканазу и имеющего размер 800 пар оснований, в качестве репортера для исследования активности промоторов.