СПОСОБ ФИКСАЦИИ БОГАТЫХ ФЕНОЛАМИ ТКАНЕЙ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК G01N1/28 

Настоящее изобретение относится к области биологии, в частности методам анализа растительных тканей чайного растения, богатых фенолами, и может быть использовано как в лабораторной практике, так и в различных областях промышленности, где применяются электронно-микроскопические исследования.

Известен способ двойной фиксации глютаровым альдегидом и тетраокисью осмия для последующего электронно-микроскопического исследования, который заключается в том, что растительную ткань обрабатывают 2,5%-ным глютаровым альдегидом (pH 6,8), выдерживают 3 часа при комнатной температуре и постфиксируют 1%-ным раствором тетраокиси осмия 1 час, потом материал обезвоживают водными растворами этанола (в возрастающей концентрации от 10 до 100%), затем ацетоном и заключают в эпон (Б.Уикли. Электронная микроскопия для начинающих. Издательство "Мир", Москва, 1975, с. 36-44).

Однако при этом способе фиксации тканей в клетках, содержащих фенольные соединения, цитоплазма приобретает темную окраску, препятствующую исследованию тканей из-за выхода фенольных соединений из вакуоли в цитоплазму. В этом случае вакуоль оказывается практически пустой, а цитоплазма на фотографии выглядит как абсолютно черная (фиг. 1).

Цель изобретения - сохранение нативной локализации фенольных соединений при электронно-микроскопическом исследовании растительных тканей и улучшение качества изображения, получаемого на электронном микроскопе.

Поставленная цель достигается тем, что предложен новый способ фиксации богатых фенолами тканей чайного растения для последующего их электронно-микроскопического исследования, заключающийся в том, что растительные ткани обрабатывают композицией, содержащей глютаровый альдегид и дополнительную компоновку в Na-фосфатном буфере (pH 6,8), выдерживают при комнатной температуре 3 часа, затем растительную ткань отмывают тем же буфером и постфиксируют раствором тетраокиси осмия 1 час, потом обезвоживают водными растворами этанола, ацетона и заключают в эпон, причем согласно изобретению композиция в качестве дополнительной компоненты содержит кофеин в концентрации 0,5 - 1,5%, а отмывку тканей проводят таким же буфером с добавлением кофеина в той же концентрации, что и в композиции.

Выбор заявляемых интервалов концентраций добавляемого кофеина определяется следующим образом: при добавлении кофеина в концентрации менее 0,5% не сохраняется нативная структура растительной ткани и происходит потемнение цитоплазмы, а значит, получается плохое качество изображения на электронном микроскопе. При добавлении же кофеина более 1,5% нарушается структура клетки и исследование становится нецелесообразным.

Суть настоящего изобретения заключается в том, что при добавлении кофеина происходит связывание фенольных соединений - образование танната кофеина, следовательно сохранение их нативной локализации и лучшее выявление структуры тканей.

Настоящее изобретение имеет "изобретательский шаг", так как позволило получить качественное изображение и в дальнейшем провести более детальные исследования по изучению внутриклеточной локализации фенольного метаболизма.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Приготовленную для электронно-микроскопического исследования растительную ткань чайного растения обрабатывают композицией, состоящей из 2,5%-ного раствора глютарового альдегида и 1%-ного раствора кофеина в Na-фосфатном буфере (pH 6,8), выдерживают при комнатной температуре 3 часа, затем ткань постфиксируют 1%-ным раствором тетраокиси осмия, потом отмывают тем же буфером с добавлением 1%-ного раствора кофеина. Далее материал обезвоживают водными растворами этанола и ацетона, затем заключают в эпон.

Изображение, получаемое на электронном микроскопе, представлено на фиг. 2.

Пример 2.

Приготовленную для электронно-микроскопического исследования растительную ткань чайного растения обрабатывают композицией, состоящей из 2,5%-ного раствора глютарового альдегида и 0,5%-ного раствора кофеина в Na-фосфатном буфере (pH 6,8), выдерживают при комнатной температуре 3 часа, затем ткань постфиксируют 1%-ным раствором тетраокиси осмия, потом отмывают тем же буфером с добавлением 0,5%-ного раствора кофеина. Далее материал обезвоживают водными растворами этанола и ацетона, затем заключают в эпон.

Изображение, получаемое на электронном микроскопе представлено на фиг. 2
Пример 3.

Приготовленную для электронно-микроскопического исследования растительную ткань чайного растения обрабатывают композицией, состоящей из 2,5%-ного раствора глютарового альдегида и 1,5%-ного раствора кофеина в Na-фосфатном буфере (pH 6,8), выдерживают при комнатной температуре 3 часа, затем ткань постфиксируют 1,5%-ным раствором тетраокиси осмия, потом отмывают тем же буфером с добавлением 1%-ного раствора кофеина. Далее материал обезвоживают водными растворами этанола и ацетона, затем заключают в эпон.

Изображение, получаемое на электронном микроскопе, представлено на фиг. 2
В результате этого способа фиксации происходит сохранение нативной локализации фенольных соединений при электронно-микроскопическом исследовании растительных тканей чайного растения и улучшение качества изображения, получаемого на электронном микроскопе.

Способ относится к методам анализа тканей растений, богатых фенолами. Он включает обработку растительных тканей композицией, содержащей глютаровый альдегид и дополнительную компоненту в Na-фосфатном буфере, и выдержку в течение 3 ч при комнатной температуре. После чего растительную ткань отмывают тем же буфером и постфиксируют раствором тетраокиси осмия в течение 1 часа, потом обезвоживают водными растворами этанола, ацетона и заключают в эпон. Композиция в качестве дополнительной компоненты содержит кофеин в концентрации 0,5-1,5%, а отмывку тканей производят таким же буфером с добавлением кофеина, что и в композиции. В результате происходит сохранение нативной локализации фенольных соединений при электронно-микроскопическом исследовании растительных тканей чайного листа и улучшение качества изображения, получаемого на электронном микроскопе. 2 ил.

Способ фиксации богатых фенолами тканей чайного растения, заключающийся в том, что растительные ткани обрабатывают композицией, состоящей из глютарового альдегида и дополнительной компоненты в Na-фосфатном буфере и выдерживают при комнатной температуре 3 ч, затем ткань отмывают тем же буфером и постфиксируют раствором тетраокиси осмия 1 ч, потом материал обезвоживают водными растворами этанола, ацетона и заключают в эпон, отличающийся тем, что в качестве дополнительной компоненты используют кофеин в концентрации 0,5 - 1,5%, а отмывку тканей проводят таким же буфером с добавлением кофеина в той же концентрации, что и в композиции.