СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии и педиатрии.

Известен способ определения протеолитической активности желудочного сока по величине протеолитической активности уропепсиногена Ансона-Мирского (1932 г. ) в модификации Розенбаха (Rosenbach J.L'uropepsine inturt de son dosage en pathologic digestive. //Paris, 1960). Способ основан на свойстве пепсина отщеплять тирозин и триптофан от белковой молекулы, и предусматривает определение активности уропепсиногена в суточной моче.

Основными недостатками указанного метода являются:
1) Отсутствие адекватного контроля. Рекомендуемый контроль учитывает оптическую плотность реактивов, используемых в методике. В контрольную пробирку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, и с нею последовательно проводят все биохимические реакции, как и с опытом. Это не позволяет учесть базовое содержание конечных продуктов биохимической реакции (тирозина и триптофана) в моче, что делает его непригодным для оценки протеолитической активности желудочного сока.

2) Определение протеолитической активности в суточной моче, в то время как содержание пепсиногена в дневных порциях мочи изменяется в зависимости от многих внешних и внутренних причин, что делает его непригодным для оценки влияния интересующих факторов на протеолитическую активность желудочного сока.

3) Способ не предлагает критерии оценки полученного результата.

Целью данного изобретения является повышение точности определения протеолитической активности желудочного сока по значению протеолитической активности уропепсиногена и возможность адекватной оценки полученного результата.

Настоящая цель достигается тем, что для повышения точности способа к каждому опыту ставится индивидуальный контроль, который позволяет учесть базовое содержание тирозина и триптофана в моче, определение протеолитической активности уропепсиногена производится в утренней порции мочи. Оценка протеолитической активности желудочного сока производится с учетом распределения показателей протеолитической активности уропепсиногена в популяции.

Методика осуществления способа.

Определение ПАУ производится в утренней порции мочи. Образцы мочи до исследования хранятся при температуре 4^oC без добавления консервантов не менее суток (до 30 суток). Для воспроизведения данного метода использовались следующие реактивы:
1) Раствор соляной кислоты (30 мл концентрированной соляной кислоты на 100 мл дистиллированной воды);
2) 0,5%-ный нормальный раствор едкого натра;
3) 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;
4) Реактив Фолина;
5) 1%-ный водный раствор гемоглобина.

Ход исследования:
Из утреней порции мочи отбирают 10 мл в стеклянный стаканчик с отметкой, подкисляют раствором соляной кислоты до pH 1,5 под контролем лакмусовой бумаги. Таким же путем доводят раствор гемоглобина до pH 1,5. В 2 пробирки отмеривают по 0,5 мл подкисленной мочи каждого образца, в первую добавляют 2,5 мл раствора гемоглобина, во вторую (контрольную) 2,5 мл дистиллированной воды, затем обе пробирки помещают в термостат и выдерживают при 37^oC в течение 30 минут. Затем добавляют 5 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, фильтруют опыт и контроль и в фильтре определяют тирозин.

С этой целью к 1 мл фильтрата добавляют 2,5 мл дистиллированной воды, 4 мл раствора щелочи и 1,5 мл реактива Фолина, предварительно разведенного водой в 3 раза. После добавления последнего развивается голубая окраска. Через 45 минут на фотометре определяют оптическую плотность при длине волны 640. Опыт сравнивают с контролем. Результат умножают на 100 для удобства работы с результатами.

(D контроль - D опыт) 100=Результат в условных единицах (у.е.),
где D - показатели оптической плотности.

Оценка результата производится с учетом бимодальности распределения ПАУ в популяции. Если результат относится к 1-ой моде (от 0 до 5 у.е.), то ПАУ оценивается как "нормальная". Если результат относится к 2-ой моде и антимоде (от 6 у.е. и выше), то ПАУ оценивается как "повышенная" и учитывается как маркер прдъязвенного состояния.

Доказательства получения положительного эффекта:
При проведении биохимического определения активности уропепсиногена в моче было показано, что базовое содержание тирозина и триптофана в моче (D-контроль) могло в несколько раз повысить разницу показателей оптической плотности (D-опыт - D-контроль). Таким образом, если не учитывать базовое содержание тирозина и триптофана, оценка активности уропепсиногена по отщеплению тирозина и триптофана от белковой молекулы становится невозможной. Предусмотренный в предлагаемом способе контроль учитывает базовое содержание конечных продуктов биохимической реакции.

Предлагаемый способ предусматривает определение активности уропепсиногена в утренней порции мочи, когда накопление мочи идет в течение длительного межпищеварительного периода и ограничено действие других второстепенных факторов, влияющих на выделение уропепсиногена (стрессы, физическая нагрузка). Это позволяет оценивать генетически закрепленный уровень пепсиногенообразования и его изменение в зависимости от состояния слизистой оболочки желудка.

Бимодальность распределения показателей ПАУ, выявленная при определении протеолитической активности уропепсиногена предлагаемым методом, свидетельствует о генетической детерминировности данного признака в популяции. "Естественная граница" - антимода (6 у.е.) позволяет оценивать показатели по принадлежности к значениям 1-ой (от 1 у.е. до 5 у.е.) как "нормальные" антимоды и 2-ой моды (от 6 у.е. до 22 у.е.) как "повышенные".

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Пациент Д., 37 лет.

При определении протеолитической активности уропепсиногена по методике Ансона-Мирского в модификации Розенбаха получены следующие показатели оптической плотности:
D-контроль - 0,03 единицы оптической плотности учитывает только оптическую плотность используемых реактивов.

D-опыт - 0,65 единиц оптической плотности.

D-опыт - D-контроль 100=62 у.е. - абсурдное значение.

Контроль, выполненный предложенным способом, составил - 0,63 единицы оптической плотности
D-опыт - D-контроль 100=(0,65-0,63) 100=2 у.е.

ПАУ 2 у.е. относится к значениям 1-ой моды, что свидетельствует о нормальной протеолитической активности желудочного сока.

Пример 2.

Нана В., 14 лет. Обследована амбулаторно. В течение 3-х лет жалуется на периодические боли в животе, связанные с приемом пищи (тощаковые и поздние). Мать, 37 лет, здорова. Отец 38 лет, с 20 лет страдает дуоденальной язвой.

Ребенку произведена оценка протеолитической активности желудочного сока по значению протеолитической активности уропепсиногена. ПАУ - 11 у.е. На основании проведенного исследования у ребенка была выявлена повышенная протеолитическая активность желудочного сока, что обусловило проведение мероприятий, направленных на снижение протеолитической активности желудочного сока и защиту слизистой оболочки желудка.

Таким образом, применение способа оценки протеолитической активности желудочного сока приводит к следующим положительным результатам.

1. Модифицированный контроль предусматривает учет базового содержания тирозина и триптофана в моче.

2. Определение протеолитической активности уропепсиногена (ПАУ) в утренней порции мочи позволяет избежать влияния второстепенных факторов, влияющих на выделение уропепсиногена.

3. Оценка результатов производится с учетом бимодальности распределения показателей ПАУ в популяции.

4. Упрощен способ контроля за подкислением мочи.

5. Способ позволяет предотвратить получение "отрицательного" результата, когда оптическая плотность контроля превышает оптическую плотность опыта.

Способ может быть использован в медицине для определения протеолитической активности желудочного сока. Определяют протеолитическую активность уропепсиногена (ПАУ) путем определения в утренней порции мочи базового содержания тирозина и триптофана путем определения оптической плотности опытного образца. Оценку протеолитической активности проводят путем вычисления разницы между значениями опытного и контрольного образцов. При значении ПАУ от 0 до 5 у.е. протеолитическую активность желудочного сока оценивают как нормальную, а при значении от 6 у.е. до 22 у.е. - как повышенную. Предлагаемый способ позволяет выявить детей с повышенными протеолитическими свойствами желудочного сока на основании исследования мочи.

Способ оценки протеолитической активности желудочного сока, включающий биохимический метод определения протеолитической активности уропепсиногена (ПАУ), путем определения в моче тирозина и триптофана, отличающийся тем, что исследование производят в утренней порции мочи, вычисляют базовое содержание тирозина и триптофана путем определения значений оптической плотности опытного образца (содержащего гемоглобин) и контрольного образца (содержащего дистиллированную воду), а оценку протеолитической активности желудочного сока проводят путем вычисления разницы между значениями опытного и контрольного образцов и при значении ПАУ от 0 до 5 у.е. протеолитическую активность желудочного сока оценивают как нормальную, а при значении от 6 до 22 у.е. как повышенную.