СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ОКИСЛЕНИЮ ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности (ЛНП) сыворотки крови и предназначается для оценки предрасположенности ЛНП подвергаться окислительной модификации, то есть приобретать потенциально атерогенные свойства.

Известен метод выделения ЛНП из сыворотки крови осаждением гепарином [1, 2] , при котором ЛНП из сыворотки крови осаждают в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки), перемешивают, оставляют на 30 минут при 0^oC, центрифугируют 30 минут при 1500 об/мин при 0^oC, после чего осадок содержит преципитированные ЛНП.

Также известен способ исследования резистентности ЛНП к окислению, являющийся прототипом (основой) предлагаемого изобретения, при котором осуществляется инкубация ЛНП в фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 5-10 мкМ ионов меди при 37^oC в течение 2 ч и более, а выделение ЛНП осуществляют методом последовательного ультрацентрифугирования в плотности KBr (1,019-1,063 г/мл) [3].

Недостатком данного метода выделения ЛНП является его длительность (20-24 часа), в течение которой ЛНП уже подвергаются окислительной модификации в результате истощения в них запасов витамина E, что в дальнейшем приводит к искажению результатов исследования за счет укороченной первой фазы (лаг-фазы) окисления ЛНП. Также недостатком данного метода является то, что для его выполнения необходимо наличие дорогостоящего оборудования, а именно ультрацентрифуги Бекман (США).

Заявленный способ отличается от известного тем, что ЛНП выделяют гепарин-осаждающим методом путем добавления к 2 мл сыворотки крови 400 ЕД гепарина (из фармакопейного раствора, содержащего 5000 ЕД/мл), перемешивания, добавления 150 мкл 1 М раствора хлорида марганца, перемешивания. Пробу оставляют на 30 минут при 0^oC , центрифугируют при 0^oC 30 минут, осадок промывают 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия, центрифугируют, осажденные ЛНП растворяют в 1 мл 1 М раствора хлорида натрия. В полученных ЛНП измеряют белок по общепринятому методу Лоури и соавторов (1951 г.) и пробы, содержащие 0,2 мг белка ЛНП инкубируют в среде Дульбекко без кальция и магния на водяной бане при 37^oC в течение 2 часов в присутствии 50 мкМ ионов меди, так как именно при этой концентрации ионов меди, согласно данным наших исследований, происходит наибольшее окисление осажденных гепарином ЛНП, что способствует повышению точности предлагаемого способа.

Далее окислительную модификацию ЛНП оценивают с помощью определения ТБК-реактивных продуктов, а именно малонового диальдегида (МДА), флуориметрическим методом [4]. Результаты выражают в нМ МДА/мг белка ЛНП.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что перед исследованием резистентности к окислению ЛНП практически не подвергаются окислительной модификации, так как метод их выделения занимает непродолжительное время (1,5 часа). Кроме того, преимуществом способа является отсутствие необходимости дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуги Бекман (США).

Проведено сравнительное исследование между известным способом [3] определения резистентности к окислению ЛНП, полученных методом ультрацентрифугирования, и предлагаемым способом определения резистентности к окислению ЛНП, полученных методом осаждения гепарином при обследовании 85 пациентов, в том числе 37 человек, больных ИБС, и 48 здоровых доноров. Оказалось, что количество МДА после 2 часов окисления как ЛНП, выделенных методом ультрацентрифугирования, так и ЛНП, выделенных методом осаждения, было достоверно повышено (p<0,001) у больных ИБС по сравнению со здоровыми донорами и составляло для ультрацентрифугированных ЛНП 33,4±1,2 и 14,9±3,3 нМ МДА/мг белка ЛНП, соответственно, а для осажденных ЛНП 22,5±1,0 и 13,2±0,9 нМ МДА/мг белка ЛНП, соответственно. Кроме того, при этом исследовании была обнаружена сильная положительная корреляция (r=+0,98) между известным и предлагаемым способами определения резистентности ЛНП к окислению. Таким образом, применение обоих способов выявляет достоверное снижение резистентности к окислению ЛНП у больных ИБС по сравнению со здоровыми донорами.

Определение резистентности осажденных ЛНП к окислению предлагаемым способом при обследовании 89 здоровых доноров выявило, что количество МДА после 2 часов инкубации ЛНП находится в пределах от 7,4 до 17,6 нМ МДА/мг белка ЛНП.

Таким образом, заявляемый способ является информативным и диагностически значимым, так как позволяет оценить предрасположенность ЛНП подвергаться окислительной модификации, то есть приобретать потенциально атерогенные свойства, поскольку известно, что окислительная модификация ЛНП играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза.

Преимуществами способа являются относительная простота технического выполнения, так как работа осуществляется силами одного врача-лаборанта и небольшое время исследования, поскольку обследование одного больного занимает максимально 6 часов.

Способ может быть использован в условиях клинических биохимических лабораторий с целью оценки способности ЛНП подвергаться окислительной модификации и, таким образом, приобретать потенциально атерогенные свойства.

Источники информации
1. Burstein М., Scholnik H.R. Lipoprotein-polyanion-metal interactions // Adv. LipidRes. - 1973.- V. 11.- P. 63-108.

2. Lindgren F.T., Silvers A., Jutagir R. et al. A comparison of simplified methods for lipoprotein quantification using the analitic ultracentrifuge as a standart //Lipids - 1977.- V. 12, N. 3.- P. 278-282.

3. Esterbauer H. , Striegl G., Puhl H., Rotheneder М. Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein //Free Radic. Res. Commun.- 1989.-V.6.- P. 67-75.

4. Schuh J., Fairclough G.F. and Haschemeyer R.H. Oxygen-mediated heterogeneity of apo-low density lipoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1978. - V. 75.- P. 3173-3179.

Способ может быть использован в медицине, а именно для определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности (ЛНП) сыворотки крови и предназначается для оценки предрасположенности ЛНП подвергаться окислительной модификации, то есть приобретать потенциально атерогенные свойства. Способ заключается в получении ЛНП из сыворотки крови осаждением в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки) при 0°С, промывании осажденных ЛНП 0,9%-ным раствором хлорида натрия, растворении их в 1 мл 1 М раствора хлорида натрия, измерении в них концентрации белка, после чего пробы, содержащие 0,2 мг белка ЛНП, инкубируют в среде Дульбекко без кальция и магния при 37°С в течение 2 ч в присутствии 50 мкМ ионов меди и далее определяют концентрацию конечного продукта процесса перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) флуориметрическим методом. Способ значительно сокращает время исследования и может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий.

Способ определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности (ЛНП) сыворотки крови, включающий выделение ЛНП, измерение в них концентрации белка, инкубацию в течение 2 ч при 37^oC в присутствии ионов меди, последующее определение концентрации продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида - флуориметрическим методом и оценку результатов, отличающийся тем, что ЛНП выделяют гепарин-осаждающим методом в присутствии хлорида марганца, центрифугируют, ЛНП промывают 0,9% раствором хлорида натрия, ценрифугируют, растворяют в 1 мл 1 М раствора хлорида натрия, и пробы, содержащие 0,2 мг белка липопротеинов, инкубируют в среде Дульбекко без кальция и магния в присутствии 50мкМ ионов меди.