СПОСОБ АНАЛИЗА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам, позволяющим регистрировать присутствие модифицированных окислением липопротеинов низкой плотности (ЛНП) в сыворотке крови человека, например, с целью выявления риск-фактора развития атеросклероза.

Известно, что ЛНП, модифицированные в результате активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), т.е. окисленные ЛНП (ок-ЛНП), могут играть ключевую роль в развитии ряда патологических состояний, в частности, атеросклероза [1] а их присутствие в крови является важнейшим риск-фактором развития этого заболевания.

В настоящее время в крови человека обнаружено присутствие фракции ок-ЛНП (до 20% от общей фракции ЛНП). У больных атеросклерозом количество ок-ЛНП увеличено по сравнению со здоровыми донорами [2] Однако, используемый в цитируемой работе хроматографический метод выявления ок-ЛНП чрезвычайно трудоемок и сопряжен с большими временными затратами (несколько часов на анализ). Более того он требует предварительного выделения общей фракции ЛНП из сыворотки, и не может быть использован с целью быстрого анализа крови на присутствие в ней ок-ЛНП.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, описанный в работе [3] (прототип). Суть его заключается в следующем: к 100 мкл ЛНП, предварительно выделенных из сыворотки методом ультрацентрифугирования и отдиализованных в течении 15-20 час. добавляют 1 мл реагента (представляющего собой смесь 6-и компонентов: 0,2 М фосфат калия, 0,12 М йодистого калия, 0,15 мм азида натрия, 2 г/л полиэтиленгликоля, 0,1 г/л алкилбензилдиметиламмонийхлорида, 10 мкМ молибдата аммония), 24 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 20 мкМ бутилированного гидрокситолуола. Далее смесь инкубируют 30 мин в темноте и измеряют на спектрофотометре светопропускание при 365 нм (6 манипуляций не считая выделения ЛНП из сыворотки). Данный метод имеет ряд недостатков:
1. ЛНП необходимо изолировать из сыворотки методом центрифугирования. Эта операция трудоемка и занимает в общей сложности около 2 суток.

2. Изолированные ЛНП необходимо диализовать от избытка NaBr, добавленного в период выделения, в течение нескольких часов.

3. В период такого длительного выделения ЛНП могут претерпевать окислительную модификацию, что искажает суть получаемых результатов.

4. Определение продуктов окисления липидов осуществляется по реакции:
ROOH + 2I^- + 2Н⁺---> I₂ + RОН + Н₂О
т. е. определяется только гидроперекиси липидов (ROOH). Однако в ходе окисления ЛНП образуются много других молекулярных (альдегиды, кетоны) и радикальных (ОН_., липидные радикалы и т.п.) продуктов, участие которых в окислотельной модификации ЛНП остается неучтенным.

5. Указанная выше реакция не является специфической, поскольку I^- может взаимодействовать с другими окислителями, присутствующими в системе (например, с ионами металлов переменной валентности).

6. Предлагаемый в прототипе коммерческий препарат является смесью 6-и реактивов и выпускается только фирмой Merck (ФРГ), катал. N 14106.

Целью данного изобретения является ускорение и упрощение способа, а также повышение его специфичности.

Указанная цель достигается тем, что в присутствии 4-6 раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) ЛНП агрегируют непосредственно в сыворотке (объемное соотношение сыворотка:ПЭГ от 1:10,8 до 1:5,4). Причем ок-ЛНП агрегируют эффективнее. Это дает возможность, анализируя светопропускание сыворотки выявлять присутствие ок-ЛНП в ней. Важно, что в этом случае нет необходимости осуществлять трудоемкие и длительные (>2 суток) процедуры по выделению фракции ЛНП из крови. Измерения ведутся непосредственно в сыворотке. Способ осуществляется следующим образом:
1. К 150 мкл: сыворотки крови человека (кровь берется натощак) добавляется 1,35 мл 5% ного раствора ПЭГ в 145 мМ NaСl, 10 мм трис-HCI, рН 7.4.

2. Смесь перемешивается и через 3-5 мин измеряется светопропускание при 600 нм. В кювете сравнения: 150 мкл сыворотки + 1,35 мл 145 мм NaCI, 10 мм трис-HCI, рН 7.4.

Для сыворотки, содержащей нативные ЛНП, светопропускание составляет 73,6+1,0 Если светопропускание имеет меньшие значения, то регистрируется присутствие ок-ЛНП в сыворотке.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами:
Пример 1. Данный пример поясняет оптимальную продолжительность предварительной инкубации смеси сыворотки с ПЭГ. В кювету спектрофотометра вносится 150 мкл сыворотки крови человека, добавляется 1,35 мл 5% раствора ПЭГ в 145 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 7,4. Смесь быстро перемешивается и регистрируется кинетика светопропускания при: 600 нм. В кювете сравнения все компоненты, за исключением ПЭГ. Кинетическая кривая представлена на фиг.1. Процесс агрегации завершается за 3 мин, и в дальнейшем значение светопропускакия не изменяется по крайней мере в течение 20 мин. т.е. этого времени инкубации (3-5 мин) вполне достаточно для измерения установившегося значения светопропускания.

Пример 2. Данный пример поясняет оптимальное соотношение сыворотка: ПЭГ. В пробирку помещается 125 мкл сыворотки, добавляются раствор ПЭГ, содержащий 145 мм NaCI, 10 мм трис-HСl, рН 7,4. Конечный объем образца 1,5 мл, концентрация ПЭГ 6% соотношение сыворотка: ПЭГ равно 1:10,8. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 3-5 мин при комнатной температуре. Далее регистрируют светопропускание образцов при 600 нм. Светопропускание равно 49%
Пример 3. Данный пример осуществляется аналогично примеру 2 с той лишь разницей, что в пробирку берут 250 мкл сыворотки соотношение сыворотка: ПЭГ равно 1:5,4. Значение светопропускания равно 45%
На фиг. 2 приведена зависимость светопропускания образцов от количества сыворотки, добавленной в кювету. Видно, что при малых объемах сыворотки (0-125 мкл, т.е. вплоть до соотношения сыворотка:ПЭГ, равного 1:10,8) наблюдается закономерное снижение светопропускания по мере увеличения объема сыворотки (т. е. увеличения отношения сыворотка:ПЭГ), внесенной в кювету. Начиная с 125 мкл (т.е. с соотношения сыворотка: ПЭГ, равного 1:10,8) дальнейшее увеличение количества сыворотки в образце не приводит к снижению светопропускания т. е. в этом диапазоне объема сыворотки (125-250 мкл, что соответствует соотношению сыворотка: ПЭГ от 1:10,8 до 1:5,4) светопропускание практически не зависит от количества сыворотки в кювете. Т.о. работа с объемами сыворотки 125-250 мкл позволяет избежать ошибку в определении светопропускания, связанную с разницей в концентрации компонентов сыворотки для различных доноров. Однако, различия, связанные с качественными особенностями агрегирующих компонентов сыворотки в этом случае должны проявиться. Следующие примеры демонстрируют специфичность метода.

Пример 4. Предварительно методом препаративного ультрацентрифугирования из сыворотки крови изолируются липопротеины низкой плотности (ЛНП). В пробирку помещают 150 мкл ЛНП, добавляют 1,35 мл 4,44%-наго раствора ПЭГ, содержащего 145 мм NaCI, 10 мм трис-HCI, рН 7,4, так что конечная концентрация ПЭГ равна 4,0% Содержимое пробирки перемешивают и через 3-5 мин регистрируют светопропускание образцов при 600 нм. В кювете сравнения все компоненты, кроме ПЭГ. Полученное значение светопропускания составило 99%
Пример 5. Данный пример осуществляется аналогично примеру 4 с той лишь разницей, что в пробирку добавляют 1,35 мл 6,67%-ного раствора ПЭГ содержащего 145 мМ NaCl, 10 мм трис-HCI, рН 7,4, так что конечная концентрация ПЭГ равна 6,0% Полученное значение светопропускания составило 39%
На фиг.3 приведены результаты, полученные с использованием ЛНП, ЛП очень низкой плотности (ЛОНП), высокой плотности (ЛВП) и сыворотки. Видно, что изолированные ЛОНП практически не агрегируют в диапазоне концентраций 2-8% ПЭГ. ЛВП начинают агрегировать с концентрации ПЭГ > 6% ЛНП начинают агрегировать при меньших концентрациях ПЭГ (около 5%). Причем процесс при незначительном увеличении концентрации ПЭГ (с 5 до 7%) сильно выражен и характеризуется резким снижением светопропускания (со 100 до 2%). Т.о. в диапазоне концентраций ПЭГ 4-6% в сыворотке из всех классов ЛП агрегируют только ЛНП.

Пример 6. В пробирку помещают 150 мкл ЛНП (предварительно выделенные из сыворотки методом препаративного ультрацентрифугирования), содержащих 0,68 мкмоль МДА на грамм белка, добавляют 1,35 мл 5%-ного раствора ПЭГ, содержащего 145 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 7,4. Содержимое пробирки перемешивают и через 3-5 мин регистрируют светопропускание при 600 нм против контрольной пробы, не содержащей ПЭГ. Концентрация ПЭГ в пробе 4,5% Светопропускание составило 88%
Результаты аналогичных опытов приведены на фиг.4. Видно, что чем больше окислены ЛНП (чем больше они содержат одного из продуктов ПОЛ МДА), тем лучше они агрегируют при одних и тех же концентрациях ПЭГ. Наибольшая разница по сравнению с неокисленными ЛНП наблюдается в диапазоне концентраций ПЭГ 4-6%
Пример 7. В пробирку помещают 150 мкл ЛНП, содержащих 0,24 мкмоль МДА на грамм белка, и 300 мкл аутологичной сыворотки, из которой предварительно методом препаративного ультрацентрифугирования удалены ЛНП. Таким образом моделируется сыворотка, содержащая ЛНП, окисленные до определенной степени. В пробирку добавляется 1,35 мл 5%-ного раствора ПЭГ, содержащего 145 мм NaCl, 10 мм трис-HCI, рН 7,4. Конечная концентрация ПЭГ в пробе 4,5% Содержимое пробирки перемешивают и через 3-5 мин регистрируют светопропускание против контрольной пробы, не содержащей ПЭГ. Светопропускание равно 91%
Результаты аналогичных опытов приведены на фиг.5. Видно, что и в составе смоделированной сыворотки более окисленные ЛНП агрегируют эффективнее. Наибольшая разница достигается в диапазоне концентраций ПЭГ 4-6%
Пример 8. 150 мкл сыворотки смешивают с 1,35 мкл 5%-ного раствора ПЭГ, содержащего 145 мм NaCl, 10 мМ трис-HCI, рН 7,4. Конечная концентрация ПЭГ 4,5% Содержимое пробирки перемешивают и через 3-5 мин регистрируют светопропускание при 600 нм против пробы, не содержащей ПЭГ. Значение светопропускания 74,5%
Анализ сывороток 100 доноров показал следующие результаты (см. табл.). Для 38 доноров, уровень МДА у которых в ЛНП составил 0,042 ±0,004 мкмоль/г белка (что соответствует норме), светопропускание имело следующее значение 73,6 ± 1,0% Для 26 доноров с повышенным уровня МДА в ЛП светопропускание составило 60,9 ± 2,1% Для 36 доноров с еще более высоким уровнем МДА в ЛП (0,102 ± 0,024) светопропускание имело значение 57,3 ± 2,2%
Таким образом, из приведенных выше примеров следует, что:
1) 3-5 мин инкубации смеси сыворотки с ПЭГ достаточно для измерения установившегося значения светопропускания;
2) использование сыворотки в объеме 125-250 мкл (соотношение сыворотка: ПЭГ от 1:10,8 до 1:5,4) позволяет измерять различие в светопропускании, связанное с изменением физико-химических свойств ЛП, а не с их количественным составом;
3) в присутствии 4-6% ПЭГ из сыворотки агрегируют ЛНП, причем более окисленные ЛНП агрегируют эффективнее;
4) обнаруженное значение светопропускания менее 73,6 ± 1,0% свидетельствует о наличии в сыворотке окисленных ЛНП.

Предлагаемый способ отличается простотой. Включает в себя всего 2 операции: смешивание сыворотки с раствором ПЭГ и регистрация светопропускания (в прототипе 6 операций). Для его осуществления необходимы широко распространенные реактивы: ПЭГ, NaСl и трис-HCL.

Способ позволяет регистрировать наличие окисленных ЛНП непосредственно в сыворотке без предварительного ее фракционирования. Способ быстр (не более 5 мин на 1 анализ) и уже сейчас может послужить основой для разработки методов диагностики, контроля за лечением и прогнозирования развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Литература.

1. Steinbrecher U.P. Zhang Н. Lougheed М. Role of oxidatively modified LDL in atherosclerobis. Free Rad.Biol.Med. 1990, v.9, p.155-168.

2. Avogaro P. Ben Bittolo G. Cazzolato (3. Presence of a modified low density lipoprotein in humans. Arteriosclerosis, 1988, v.8, p.79-87.

3. EI-Saadani M. Esterbauer H. EI-Bayed M. Goher M. Nassar A.Y. Jutgens G. A spectophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent. J.Lipid Res. 1989, v.30. p.627-630. ТТТ1 ЫЫЫ2 ЫЫЫ4

Использование: медицина, для регистрации присутствия модифицированных окислением липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови человека. Цель - выявление риск-фактора развития ряда заболеваний, в частности атеросклероза. Сущность изобретения: определяют содержание липопротеинов в цельной сыворотке крови в присутствии 4-6% раствора полиэтиленгликоля, для чего смесь инкубируют 3-6 мин, регистрируют светопропускание и при его значении менее 73,6 <$E+-> 1,05 определяют наличие окисленных липопротеинов в сыворотке. 5 ил.

Способ анализа модифицированных окислением липопротеинов в сыворотке крови человека путем обработки липопротеинов химическим реагентом с последующей регистрацией светопропускания полученной смеси, отличающийся тем, что обработку ведут в цельной сыворотке крови 4-6%-ным раствором полиэтиленгликоля, при объемном соотношении сыворотка:полиэтиленгликоль от 1:10,8 до 1: 5,4, полученный образец инкубируют 3-5 мин, определяют светопропускание и при его значении менее 73,6+1,0% регистрируют наличие окисленных липопротеинов.