СПОСОБ АНАЛИЗА ЛИПОПРОТЕИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО РЕНТГЕНОВСКОГО РАССЕЯНИЯ Российский патент 1997 года по МПК G01N23/201 G01N33/49 

Изобретение относится к технологии анализа биологических материалов, а именно к способам определения фракционно-дисперсного состава (ФДС) липопротеидов (ЛП) в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) для последующей диагностики состояния организма человека или животного.

Известен способ [1] определения ФДС ЛП крови методом электрофореза (ЭФ), заключающийся в предварительном окрашивании ЛП суданом черным, помещении окрашенного образца плазмы (сыворотки) крови на предварительно приготовленный многозонный полиакриламидный гель и помещении геля с образцом в аппарат для ЭФ. Процесс разделения ЛП под действием электрического поля происходит в течение 24 часов, затем гель фиксируется, сушится и сканируется с помощью специального устройства (сканера).

К недостаткам данного способа относится использование значительного числа реактивов, дополнительного оборудования и сложных методик приготовления красителей, геля, а также необходимость сканирования. Кроме того, этот метод не является количественным, трудно воспроизводим, а распределение (разделение) ЛП на фракции происходит по сложноопределяемому параметру - электрофоретической подвижности. Общее время анализа может составлять 7-12 часов. Однако именно этот метод принят ВОЗ как основной из-за его относительной экспрессивности и распространенности данного оборудования. Метод используется для диагностирования дислипопротеинемий (ДЛП).

Известен способ [2] заключающийся в предварительной подготовке образцов для анализа путем отделения исследуемых фракций ЛП от других белков плазмы крови с помощью препаративного ультрацентрифугирования, а также приготовление буферной смеси, используемой для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения. В образец и буфер вводят рентгеноконтрастное вещество с последующим их просвечиванием коллимированным рентгеновским пучком и измерением малоугловых рентгенограмм рассеяния от образца и буферной смеси. После математической обработки полученных данных на ЭВМ вычисляют определяемые параметры. С помощью данного способа оценивается степень гомогенности и полидисперсности выделенных фракций ЛП плазмы крови.

Недостатком данного способа является невозможность определения фракционно-дисперсного состава ЛП в цельной плазме крови методом МУУРР. В способе исследуются (анализируются) структуры отдельных фракций с различными концентрациями рентгеноконтрастного вещества (РКВ) в образцах. Для этого исследуемые фракции ЛП отделяют от других белков плазмы крови, используя дополнительное оборудование (ультрацентрифуга), в течение 24-48 ч. В данном способе для анализа ЛП не может быть использована цельная плазма крови из-за невозможности учесть вклад в рентгенограмму рассеяния ЛП, мешающее рассеяние от других белков крови (альбумин, α,β,γ-глобулины и др.) Общее время анализа по способу прототипу 26-51 ч.

Наиболее близким является способ определения ФДС ЛП крови методом спектроскопии оптического смещения (СОС), заключающийся в предварительном отделении ЛП крови от других белков плазмы с помощью высокоскоростного ультрацентрифугирования в течение 24-48 ч, просвечивании образца ЛП в кювете лазерным излучением и измерении спектра рассеянного излучения вблизи длины волны лазерного излучения, математической обработки полученного при измерении физического сигнала (спектра) 1(l) с помощью ЭВМ, определения ФДС ЛП по размерам (радиусам ЛП) N(R) [3]
Недостатками данного способа являются необходимость предварительного отделения ЛП плазмы крови от других белков крови, для чего используется дорогостоящее оборудование и в связи с этим увеличивается общая длительность анализа до 25-50 часов. Кроме того, метод СОС значительно уступает методу МУРР в разрешении, т.к. используется оптический диапазон длин волн (l 3000 - 8000), а в МУРР рентгеновский диапазон . Все это приводит к более низкой точности определения ФДС ЛП крови по сравнению с методом МУРР, особенно в отношении ЛП малого размера ЛВП. Следует отметить также пониженную информативность метода СОС вследствие косвенных оценок размера ЛП через так называемый гидродинамический радиус частиц (R), который определяется из коэффициента диффузии и стоксовского приближения.

Задачей предлагаемого технического решения является создание такого способа анализа ЛП в плазме крови методом МУРР, который позволил бы определять ФДС липопротеидов в цельной (нативной) плазме крови, использовать для анализа небольшое количество препарата, а также сократить время проведения анализа образцов плазмы крови.

Указанная задача решается тем, что в способе анализа ЛП в плазме крови методом МУРР, включающем приготовление образца плазмы крови, представляющего собой смесь белков в водном растворителе плазмы крови, и образца водного растворителя, используемого для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения, вводятся в указанные образцы водорастворимое РКВ, образцы просвечиваются коллимированным рентгеновским пучком и измеряются малоугловые рентгенограммы рассеяния от образцов плазмы крови и водного растворителя белков плазмы крови с последующей математической обработкой полученных данных на ЭВМ и вычислением определяемых параметров. Согласно изобретению, в качестве образца плазмы крови используют цельную плазму крови, рентгеноконтрастное вещество вводят в образцы цельной плазмы крови и водного растворителя белков плазмы крови в сухом виде в количестве, достаточном для получения в этих образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек липопротеидов и свободных белков плазмы крови. В качестве рентгеноконтрастного вещества используют инертные к белкам вещества с плотностью (ρ) более 1,5 г/см и значением массового коэффициента ослабления рентгеновского излучения ma, удовлетворяющем условию:
μa < Kd_opt•λ [см²/г],
где d_opt оптимальная толщина слоя анализируемого образца, см;
λ длина волны рентгеновского излучения, см;
K=6•10²⁵[1 г/см²] размерный коэффициент.

Определение ФДС ЛП в цельной плазме крови становится возможным за счет доведения в исследуемых образцах плотности водного растворителя белковых компонентов плазмы крови до плотности, равной плотности белков в исследуемой цельной плазме (1,27 г/см³). При этом обеспечивается получение такого образца цельной плазмы крови, в котором "видными" для рентгеновского рассеяния становятся только ядра липопротеидов, ФДС которых и определяется. Использованием в качестве РКВ инертных к белкам веществ обеспечивается снижение систематических погрешностей анализа за счет отсутствия взаимодействий ЛП с РКВ. При использовании РКВ, плотность которых меньше 1,5 г/см³, т.е. близка к средней плотности белков (r=1,27 г/см³), резко снижается концентрация липопротеидов в образце плазмы крови за счет значительного разведения образца при добавлении РКВ. При использовании РКВ, массовый коэффициент (ma) ослабления рентгеновского излучения которых больше значения, удовлетворяющего условию: μa > Kd_opt•λ³ (см²/г), резко возрастает длительность процесса измерения 1 (h) вследствие сильного поглощения рассеянного излучения рентгеноконтрастным веществом.

Таким образом, при использовании предлагаемых рентгеноконтрастных веществ достигается минимальное поглощение рассеянного рентгеновского излучения при минимальном разведении исследуемого образца плазмы крови. Вследствие этого статистические и систематические погрешности сводятся к минимуму.

На фиг.1 приведен график рентгенограммы МУРР в координатах 1 (h)•h⁴, h, полученной от образца плазмы крови в диапазоне углов 0,01≅h≅0,1 (с введенными поправками на фон, сглаживание и коллимацию). На фиг.2 изображен график функции D_v(R) распределения частиц (сферические липидные ядра ЛП) по размерам (фракции ЛВП и ЛНП) в диапазоне R 10-150 (здесь R радиус частиц).

Способ осуществляют следующим образом. Берут точно отмеренный объем образца нативной плазмы или сыворотки крови (50-200 мкл) и такой же объем образца буферной смеси (физраствора), используемого в качестве водного растворителя белковых компонентов плазмы крови, и смешивают отдельно каждый образец с предварительно взвешенной сухой массой выбранного рентгеноконтрастного вещества с ρ ≥ 1,5 г/см³ и с ma <kd_optλ (cм²/г) (т.к. ma ~ λ). Например, для (CuK излучение) μ <22 см²/г, а d_opt определяется как d_opt 1/m, где m линейный коэффициент ослабления рентгеновского излучения слоем образца исходной плазмы крови без РКВ. Например, при для образца - физраствора без РКВ μ 10,1/см, а d_opt 0,1 см. В качестве РКВ могут быть использованы, например, сахароза, соли LiNO₃, NaNO₃ и другие вещества, удовлетворяющие вышеприведенным условиям. Далее образцы встряхивают до полного растворения РКВ. Причем количество РКВ в этих образцах должно быть достаточным для получения в них плотности (r) растворителя белковых компонентов плазмы крови, равной плотности белков, т.е. r 1,27 г/см³ (или r 0,418 эл/ ). Для этого используют расчетную формулу (2):

где М масса используемого РКВ; V объем пробы образца; ρ₁ плотность плазмы (или растворителя крови; ρ₂ требуемая конечная плотность пробы; ρ₃ плотность сухого РКВ, используемого для увеличения плотности проб.

Например, для образца плазмы крови объемом V 50 мкл требуется сухой сахарозы (ρ 1,59 г/см), используемой в качестве РКВ, массой М 67 мг.

Такая процедура подготовки образцов плазмы (сыворотки) крови и буферной смеси для анализа позволяет после проведенных измерений интенсивностей рассеяния (1 (h)) от этих препаратов исключить рассеяние от всех присутствующих в плазме крови белков, включая рассеяние и от белковых компонент (оболочек) ЛП. Далее последовательно помещают приготовленные образцы плазмы и буфера с РКВ в специальную кювету малоуглового дифрактомера и производят измерение интенсивностей рассеяния 1(h) в диапазоне углов: 0,01 < h < 0,1, где h = 4πsinθ/λ, 2θ угол рассеяния в радианах, l длина волны используемого рентгеновского излучения в . После измерения интенсивностей 1(h) проводят предварительную математическую обработку полученных данных, включая вычитание фонового рассеяния, сглаживание данных и коллимацию с учетом эффектов поглощения образцами (Свергун Д.М. и др. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М. Наука, 1986, с.279). Поскольку известно, что структуры всех фракций ЛП крови имеют внешнюю форму, близкую к сферической, с липидными ядрами в центре и белковыми оболочками, то полученная после предварительной математической обработки интенсивность рассеяния 1(h) будет содержать информацию только о близких к сплошным сферам липидных ядрах ЛП (например, о фракциях ЛВП, ЛНП с размерами от 10 до 160 по радиусу R). На заключительном этапе анализа по предлагаемому способу проводят еще одну математическую обработку данных (интенсивностей рассеяния 1(h) с помощью специальной вычислительной программы на ЭВМ, используя известный алгоритм, основанный на Фурье-преобразовании, получая в итоге значения функции D_v(R) функции распределения частиц (сферических липидных ядер ЛП) по размерам. График этой функции передает количественную информацию о фракционно-дисперсном составе ЛП плазмы крови, поскольку известно, что белковые оболочки у всех фракций ЛП примерно одинаковы и их толщина составляет 20-22
На фиг. 1 приведен пример анализа с определением ФДС ЛП плазмы крови здорового человека методом МУРР по предложенному способу. Объем использованного для анализа образца цельной плазмы крови 0,1 мл. В качестве РВК использовалась сухая сахароза (ρ 1,59 г/см³). Общее время анализа в данном примере составило 2,5 ч. Для измерения интенсивностей МУРР использовали малоугловой рентгеновский дифрактометр фирмы SIEMENS (Германия). Полученные при измерениях данные МУРР приведены на фиг.1. На фиг.2 приведен график вычисленной из данных МУРР функции D_v(R), характеризующий ФДС ЛП анализируемого образца плазмы крови человека (субфракции ЛВП и ЛНП). Полученные в результате анализа по предлагаемому способу данные о ФДС ЛП плазмы крови здорового человека хорошо соответствуют данным о ФДС ЛП крови, получаемым способaми аналогами.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет определять ФДС липопротеидов в цельной (нативной) плазме крови методом МУРР за счет приготовления образца цельной плазмы крови таким образом, что "видимыми" для рентгеновского рассеяния становятся только ядра липопротеидов, а ФДС их однозначно связан с ФДС ЛП. При этом время анализа (см.табл.1) сокращается более чем в 10 раз по сравнению с прототипом и некоторыми аналогами. В сравнении с ЭФ время анализа в предлагаемом способе сокращается более чем в 3 раза. Кроме того, предлагаемый способ по сравнению с ЭФ и УЦ позволяет более точно воспроизводить анализ, а ФДС ЛП может оценивать количественными параметрами в прямой шкале размеров.

Изобретение относится к технологии анализа биологических материалов, а именно к способам определения фракционно-дисперсного состава (ФДС) ЛП в плазме крови методом МУРР для последующей диагностики состояния организма человека. Способ включает приготовление образца плазмы крови и образца водного растворителя белков плазмы крови, используемого для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения, и введение в указанные образцы водорастворимого рентгеноконтрастного вещества (РКВ). Образцы просвечивают коллимированным рентгеновским пучком и измеряют малоугловые рентгенограммы рассеяния от этих образцов с последующей математической обработкой полученных данных на ЭВМ и вычислением определяемых параметров. В качестве образца плазмы крови используют цельную плазму крови, РКВ вводят в образцы цельной плазмы крови и водного растворителя белков плазмы крови в сухом виде в количестве, достаточном для получения в этих образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек ЛП и свободных белков плазмы крови. Способ позволяет определять ФДС ЛП в цельной плазме крови методом МУРР. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Способ анализа липопротеидов в плазме крови, включающий приготовление исследуемого образца плазмы крови, облучение его электромагнитным излучением, измерение интенсивности рассеяния излучения образцом, математическую обработку и вычисление параметров фракционно-дисперсного состава липопротеидов, отличающийся тем, что анализ проводят на двух исследуемых образцах, причем в качестве основного образца берут цельную плазму крови с добавлением в этот образец рентгеноконтрастного вещества, а в качестве дополнительного берут водный растворитель белков плазмы крови с добавлением того же рентгеноконтрастного вещества, которое вводят в сухом виде в количестве, достаточном для получения в образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек липопротеидов в плазме крови и свободных белков плазмы крови, при этом оба образца облучают коллимированным рентгеновским излучением с последующим измерением интенсивности рассеяния в диапазоне малых углов, а математическая обработка включает вычитание фонового рассеяния. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве рентгеноконтрастного вещества используют инертные к белкам вещества с плотностью ρ более 1,5 г/см³ и значением массового коэффициента ослабления рентгеновского излучения m_a, удовлетворяющем условию
μ_a < kd_opt•λ³, см²/г,
где d_o p t оптимальная толщина слоя анализируемого образца, см;
λ - длина волны рентгеновского излучения, см;
k размерный коэффициент, равный 6 • 10^2 5, 1/г см².