АНТИГЕЛЬМИНТНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2000 года по МПК A61K9/127 A61K31/41 A61K31/47 A61K31/415 A61K31/495 A61P33/10 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, конкретно к медицинской и ветеринарной гельминтологии, и может быть использовано для лечения ларвальных эхинококкозов и других цестодозов человека и сельскохозяйственных животных.

Ларвальные эхинококкозы являются тяжелыми паразитарными заболеваниями человека и сельскохозяйственных животных, вызываемыми личинкой эхинококка и приводящими к гибели больных. Альвеолярный эхинококкоз (альвеококкоз) является заболеванием человека, а гидатидозный эхинококкоз - болезнью человека и сельскохозяйственных животных.

Для лечения ларвальных эхинококкозов применяют препараты группы карбаматбензимидазолов - альбендазол (метил-5-[пропилтио]-2- бензимидазолкарбамат) и мебендазол (метиловый эфир 5-бензоил-2-бензимидазол-карбаминовой кислоты). При экспериментальном альвеококкозе лабораторных животных терапевтическую активность проявил нокодазол (метил (5-[2-тиенилкарбонил]-1Н-бензимидазол-2-ил)карбамат). Альвеококкоз поддается лечению этими препаратами гораздо хуже, чем гидатидозный эхинококкоз. Недостатками всех этих препаратов являются высокие терапевтические дозы и отсутствие радикального терапевтического эффекта после многократных курсов лечения, что не гарантирует излечение больного на протяжение всей его жизни (p.M.Schantz et al., 1982; В.И., Джабарова и др., 1983; D.H.Taylor et al., 1988).

Наиболее близким к заявляемому техническим решением является липосомальный альбендазол (ЛА), эффективность которого испытана при экспериментальном альвеококкозе хлопковых крыс (H.Wen et al., 1996). Приготовленный по способу прототипа ЛА включает действующее вещество (альбендазол) и фосфолипид (яичный фосфатидил холин) при соотношении компонентов 1:2 соответственно. Приготовление ДА включает следующие этапы: 1) 100 мг фосфолипида растворяют в 1 мл ледяной уксусной кислоты; 2) к раствору добавляют 50 мг альбендазола и перемешивают до полного растворения последнего; 3) к полученному раствору добавляют 9 мл 2М едкого натрия, перемешивают до образования нейтрализованной суспензии ЛА; 4) полученную суспензию ЛА диализуют с 5 л 0,15М фосфатного буфера pH 7,4 при 4^oC в течение 1 суток; 5) удаляют супернатант, оставшуюся суспензию ЛА доводят фосфатным буфером до концентрации альбендазола, равной 10 мг/мл; 6) суспензию ЛА обрабатывают ультразвуком в течение 20-30 мин для уменьшения размера липосом; 7) полученный готовый к применению ЛА хранят при 4^oC и используют в экспериментах в течение срока хранения не более 3 мес. Терапевтическую активность ЛА испытывали на поздней стадии экспериментального альвеококкоза хлопковых крыс. Продолжительность инвазии у животных к моменту начала лечения составляла 3 мес. Исходную интенсивность инвазии к началу лечения по показателю средней массы паразитарных ларвоцист (ПЛ) на 1 животное не определяли. ЛА вводили животным перорально в суточной дозе действующего вещества (ДВ) 35 мг/кг в течение 8-ми 5-дневных курсов с интервалами между курсами в 2 дня. Контролем служили зараженные нелеченные хлопковые крысы. Эффективность ЛА оценивали по показателям средней массы ПЛ на 1 животное и жизнеспособности зародышевых элементов ПЛ (протосколексов) у животных сравниваемых групп. Индекс торможения роста ПЛ (ИТРПЛ) у леченных крыс рассчитывали в процентах по формуле
ИТРПЛ = (Мк - Мл)/Мк • 100,
где Мк и Мл - средняя масса ПЛ на 1 животное у контрольных и леченных крыс соответственно, вскрытых через 7 мес. после заражения. Результаты испытания показали, что ЛА вызывает только угнетение роста ПЛ и не оказывает заметное влияние на жизнеспособность паразита, о чем свидетельствуют показатели инвазии у контрольных животных (Мк = 72,4 г, спонтанная гибель протосколексов в ПЛ у 13,5% крыс) и леченных крыс (Мл = 19,4 г, ИТРПЛ = 73,2% гибель протосколексов в ПЛ у 66,7% крыс). Восприимчивость хлопковых крыс к заражению альвеококкозом составила 84,3%.

Недостатками прототипа являются:
1) низкая терапевтическая активность препарата (73%-ное торможение роста паразита, отсутствие ларвицидного эффекта);
2) недостаточная надежность модели инвазии (84%-ная заражаемость животных альвеококкоэом) и критериев для оценки влияния препарата на рост паразита (не определялась интенсивность инвазии к моменту начала лечения) и его жизнеспособность (спонтанная гибель протосколексов в ПЛ у 13,5% животных; не учитывается влияние препарата на более устойчивый к его губительному действию тип зародышевых элементов ПЛ - ацефалоцисты альвеококка).

3) неоптимальный путь применения липосомального препарата (пероральный), сопряженный с преждевременным разрушением липосом в желудочно-кишечном тракте животных и терапевтическим эффектом за счет ДВ, вышедшего из разрушенных липосом, что исключает объективную оценку антигельминтной активности применяемого липосомального препарата.

Задачи изобретения - получение липосомального препарата на основе карбаматбензимидазолов с повышенной антигельминтной активностью и оптимизация способа его применения.

Сущность изобретения состоит в том, что антигельминтное средство включает ДВ - карбаматбензимидазол (нокодазол или мебендазол), лецитин и холестерин при соотношении компонентов 1:9:1 соответственно и применяется путем ректального введения или накожных аппликаций. Введение в состав предлагаемого антигельминтного средства холестерина в качестве стабилизатора и повышенного содержания лецитина в качестве носителя позволяет повысить эффективность препарата, а его парентеральное применение обеспечивает оптимальные условия для более полной реализации целевой биологической активности.

Предлагаемое антигельминтное средство получают следующим образом. 1 часть ДВ (нокодазол или мебендазол) и 1 часть холестерина полностью растворяют в смеси хлороформ-метанол. К полученному раствору добавляют 9 частей лецитина, растворенного в этаноле. Растворители упаривают из композиции досуха до получения сухой липидной пленки. К липидной пленке добавляют физиологический раствор, воздушную фазу замещают азотом и полученную смесь герметизируют и суспендируют до образования готового продукта - гомогенной жидкости молочного цвета. Полученное антигельминтное средство применяют путем ректальных инъекций или накожных аппликаций.

Получение и эффективность предлагаемого антигельминтного средства иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Липосомальный препарат нокодазола готовили следующим образом. 100 мг нокодазола и 100 мг холестерина растворяли в 250 мл смеси хлороформ-метанол (2:1). К полученному раствору добавляли 900 мг лецитина, растворенного в 100 мл 10%-ного этанола. Растворители упаривали из композиции досуха на ротационном испарителе при температуре 35^oC до получения сухой липидной пленки. В колбу с липидной пленкой помещали стеклянные шарики (или фарфоровые кипелки), добавляли физиологический раствор в объеме 11-15 мл в соответствии с заданной концентрацией ДВ в липосомальном препарате (6,7-9,1 мг/мл). Колбу продували азотом и закрывали притертой пробкой и парафиновой пленкой. Содержимое колбы встряхивали на шуттель-аппарате до полного суспендирования липидной пленки. Об образовании липосом свидетельствовало появление окрашивания жидкости в молочный цвет. Готовый к употреблению липосомальный нокодазол, представляющий собой гомогенную микроэмульсию белого цвета со слабым специфическим запахом, разливали в резервуары или ампулы. Резервуары закрывали крышкой и парафиновой пленкой, ампулы запаивали после продувания азотом и помещали в холодильник при +4^oC до использования в течение 3 мес. хранения.

Терапевтическую активность липосомального нокодазола изучали при экспериментальном ларвальном альвеококкозе хлопковых крыс на поздней стадии инвазии после ректальных инъекций препарата. В тех же условиях эксперимента испытывали эффективность полученных вышеуказанным способом образцов липосомального нокодазола, у которых соотношение ДВ:лецитин:холестерин составляло соответственно 1:3:0,3 и 1:4,5:0,5.

В опыте использовали 35 хлопковых крыс (самцы), зараженных в возрасте 1 мес. внутрибрюшинно микроскопическими ацефалоцистами альвеококка диаметром 100-300 мкм. Каждое животное получило по 20 ацефалоцист. К моменту начала лечения длительность экспериментальной инвазии составляла 60 дней, а средняя масса ПЛ, по данным вскрытия к этому сроку 6-ти крыс, была равна 10,4. Остальных 29 крыс разделили на 4 группы по 7-8 голов в каждой. Животным трех экспериментальных групп вводили ректально образцы липосомальной формы нокодазола (ЛФН) с разным соотношением ДВ, лецитина и холестерина: 1:3:0,3 (первая группа), 1:4,5:0,5 (вторая группа) и 1:9:1 (третья группа). Препарат вводили с помощью шприца, соединенного через канюлю со съемным гибким прозрачным полиэтиленовым катетером длиной 5 см, 3 раза в день в течение 46 дней без перерывов (с 61-го по 106-й дни после заражения) в суточной дозе ДВ 0,05 г/кг (суммарная доза ДВ составила 2,3 г/кг). Невылеченные крысы четвертой группы служили контролем. Всех животных экспериментальных и контрольной групп вскрывали на 121-й день после заражения и определяли у каждой крысы массу всех выявленных ПЛ. Содержимое ПЛ подвергали микроскопическому исследованию на наличие и выраженность деструктивных изменений зародышевых элементов (протосколексов и ацефалоцист) эхинококка. Терапевтическую активность ЛФН оценивали с помощью индекса химиотерапевтической активности (ИХТА), который расчитывали в процентах по формуле
ИХТА = (Мк - Мл)/(Мк - Ми) • 100.

где Ми, Мк и Мл - средние значения массы ПД на 1 животное: исходной, у контрольных и леченных животных соответственно.

Результаты испытания терапевтической активности ЛФН показали (таблица 1), что наибольшей эффективностью обладает образец ЛФН, в котором соотношение нокодазола, лецитина и холестерина составляло 1:9:1 соответственно (ИХТА = 113,2%; деструкция протосколексов и ацефалоцист во всех ПЛ у 6-ти из 7-ми леченных животных). Более низкими были показатели терапевтической активности образцов ЛФН, в которых соотношение нокодазола, лецитина и холестерина составляло соответственно 1:4,5:0,5 (ИХТА - 107,5%; деструкция всех зародышевых элементов в ПЛ у 2-х из 7-ми леченных животных) и 1:3:0,3 (ИХТА = 98,6%; у всех леченных животных в ПЛ выявлены живые ацефалоцисты альвеококка).

Пример 2. Образцы липосомальной формы мебендазола (ЛФМ), в которых соотношение мебендазола, лецитина и холестерина составило соответственно 1:9:1, 1; 4,5: 0,5 и 1:3:0,3, готовили способом, описанным в примере 1. Терапевтическую активность ЛФН изучали при экспериментальном альвеококкозе белых мышей на ранней стадии инвазии после накожных аппликаций препарата.

В опыте использовали 37 аутбредных мышей обоего пола массой тела 18-24 г, зараженных в возрасте 1 мес. внутрибрюшинно ацефалоцистами альвеококка по 20 ацефалоцист на 1 животное. Лечение животных начинали через 10 дней после заражения при средней исходной массе ПЛ, равной 0,01 г (по данным вскрытия 6-ти мышей). ЛФМ наносили на выбритую поверхность кожи спины животных площадью около 15 см² 1 раз в день ежедневно в течение 42-х дней без перерывов в суточной дозе ДВ 0,05 г/кг. Остальные параметры эксперимента и результаты изучения терапевтической активности ЛФМ приведены в таблице 2. Как видно из таблицы, самую высокую эффективность проявил образец ЛФМ, в котором соотношение мебендазола, лецитина и холестерина соответствовало 1:9:1 (ИХТА = 99,6%; гибель всех ПЛ у 5-ти из 8-ми леченных животных). Более низкой эффективностью обладали образцы ЛФМ, в которых соотношение мебендазола, лецитина и холестерина соответствовало 1:4,5:0,5 (ИХТА = 98,7%; гибель всех ПЛ у одной из 8-ми леченных мышей) и 1:3:0,3 (ИХТА = 96,7%; у всех леченных животных в ПЛ выявлены живые ацефалоцисты альвеококка).

По данным литературы (H.Wen et al., 1996), липосомальная форма альбендазола (прототип), вводимая экспериментально зараженным альвеококкозам хлопковым крысам в течение 8-ми 5-дневных курсов с интервалами между курсами в 2 дня в суточной дозе ДВ 35 мг/кг, вызывает торможение роста ларвоцист альвеококка на 73,2%, деструкцию лишь наиболее чувствительных к препарату зародышевых элементов паразита (протосколексов) у 52,3% животных и не оказывает губительного действия на ацефалоцисты альвеококка и на паразит в целом.

Таким образом, липосомальные формы нокодазола и мебендазола обеспечивают повышение эффективности препарата, в состав которого входят карбаматбензимидазол, лецитин и холестерин при соотношении 1:9:1, и парентеральное применение которого оптимально для реализации целевой биологической активности. Заявленное антигельминтное средство обеспечивает большее торможение роста ларвоцист альвеококка (99,6-100%), деструкцию всех зародышевых элементов альвеококка (протосколексов и ацефалоцист) и излечение 62,5-85,7% экспериментально зараженных лабораторных животных (хлопковых крыс, белых мышей), по сравнению с прототипом. Кроме повышения эффективности, определены оптимальные пути применения, а также показана хорошая переносимость липосомальных форм нокодазола и мебендазола, что может служить обоснованием высокой их эффективности при ларвальных эхинококкозах человека и животных.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к медицинской и ветеринарной гельминтологии, и может быть использовано для лечения ларвальных эхинококкозов и других цестодозов человека и животных. Сущность изобретения состоит в том, что антигельминтное средство включает действующее вещество карбаматбензимидазол (некодазол или мебендазол), лецитин и холестерин при соотношении компонентов 1 : 9 : 1 соответственно и применяется путем ректальных инъекций или накожных аппликаций. Заявленное средство обеспечивает большее угнетение роста ларвоцист альвеококкоза (99,6 - 100%), деструкцию всех зародышевых элементов (протосколексов и ацефалоцист) в ларвоцистах альвеококка и гибель паразита в целом у 62,5 - 85,7%. 2 табл.

Антигельминтное средство, включающее бензимидазолкарбамат и лецитин, отличающееся тем, что оно имеет повышенное содержание лецитина, дополнительно содержит холестерин при соотношении бензимидазолкарбамата, лецитина и холестерина 1 : 9 : 1 соответственно и применяется ректально или накожно.