СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ВТОРИЧНОГО АЛЬВЕОЛЯРНОГО ЭХИНОКОККОЗА (ГИДАТИДОЗА) Российский патент 2006 года по МПК A61K31/00 A61K38/00 A61K39/00 A61P33/10 A61P37/00 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии и может быть использовано для иммунопрофилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза).

Альвеолярный эхинококкоз (гидатидоз), возбудителем которого является Echinococcus multilocularis, относится к числу наиболее опасных гельминтозоонозов, представляющих серьезную угрозу для здоровья человека и являющихся актуальными для ветеринарной медицины. Распространение цистного и альвеолярного гидатидоза за последние годы увеличивается по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальный жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля (Маркин А.В., 1999; Мусаев Г.Х., 1999 Коваленко Ф.П. и др., 2002).

Степень отрицательного влияния этой инвазии на здоровье зараженных людей трудно оценить. Болезнь в запущенных случаях неизлечима, поскольку, как правило, в этот период помимо значительного поражения печени метастазы уже имеются и в других органах и даже пересадка печени может оказаться малоэффективной. Именно поэтому проблема профилактики и лечения этого социально опасного гельминтозооноза была и остается одним из приоритетных направлений гельминтологической науки и практики.

В борьбе с альвеолярным гидатидозом наиболее приемлемыми являются два пути: химиотерапия и вакцинопрофилактика.

Химиотерапия требует не только больших доз химических препаратов, но и длительного (годы) времени их применения. Но даже в этом случае она недостаточно эффективна, поскольку происходит приостановка развития паразита, а не окончательная его гибель.

К способам профилактики вторичного альвеолярного гидатидоза относится использование специфических и неспецифических стимуляторов, позволяющих повысить резистентность животных и человека к заражению, подавлять рост метацестод E.multilocularis и вызывать гибель всей популяции паразита.

Известно, что неспецифическая резистентность мышей к заражению E.multilocutaris достигается относительно низкими дозами вакцины БЦЖ (10³-10⁷ колониеобразующих единиц), которая выражается значительно меньшими размерами паразитарных узлов у вакцинированных животных по сравнению с контрольными (Reuben, Tanner, 1978). Однако при дозе 10⁵-10⁷ единиц БЦЖ у мышей развивались туберкулезные гранулемы (Reuben et al., 1978)

Идентичный и даже более сильный эффект с полным подавлением роста метацестод Е.multilocularis наблюдали у экспериментально зараженных хлопковых крыс, которые получали дозу 26,4×10⁶ единиц БЦЖ. Эта доза хорошо переносилась и на 100% убивала ларвоцисты паразита у экспериментально зараженных монгольских песчанок (Rau, Tanner, 1975).

Однако наблюдаемое при повышенных дозах БЦЖ развитие у мышей туберкулезных гранулом требует более тщательной отработки дозы этой вакцины и разработки лечения туберкулом (Thompson, 1976).

Защита от альвеолярного гидатидоза достигалась также стимулированием хлопковых крыс клеточным перитонеапьным экссудатом, полученным через 3 дня после внутрибрюшинного введения фитогемагглютинина. Такая процедура в значительной мере предохраняла животных от развития ларвоцист Echinococcus multilocularis в брюшной полости и во внутренних органах (Reuben, Tanner, 1983)

Наиболее близким к заявляемому техническим решением является создание специфических генно-инженерных вакцин, развитие которых находится на самой ранней стадии и включает в первую очередь клонирование протективного гена.

Известна рекомбинантная вакцина, представляющая собой фрагмент гена II/3-IO метацестоды Е.multilocularis, кодирующего видоспецифический антиген и экспрессированного в ослабленный вакцинный штамм Salmonella typhimurium, которая при подкожном и пероральном введении вызывала у мышей и собак гуморальный и клеточный иммунный ответ. При обоих способах введения вакцины наблюдали синтез антител против антигенов S.typhimurium и рекомбинантного антигена Е.multilocularis, но пролиферацию лимфоцитов периферической крови на антигены не отмечали. В ответ на рекомбинантный антиген Е.multilocularis у собак отмечали местную пролиферацию только при подкожном введении вакцины (Gottstein et al., 1990).

В отношении применения рекомбинантных вакцин при паразитарных заболеваниях, включая и вторичный альвеолярный и цистный гидатидозы, существует авторитетное мнение большинства ученых о перспективности проведения дальнейших исследований в этом направлении с включением таких вопросов как отработка доз, способов введения вакцин, изучение способности вакцин обеспечивать элиминацию или гибель паразитов и развитие иммунной памяти (Бессонов А.С., 2000).

Учитывая серьезную опасность альвеолярной формы эхинококкоза (гидатидоза) для людей и перспективность развития вакцинопрофилактики этой инвазии была проведена работа по разработке способа профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза) на модели мышь - Е.multilocularis; крыса - Е.multilocularis с использованием специфического антигенного препарата и неспецифического иммуномодулятора.

Специфический антиген является главной составной частью иммунопрепаратов, способствующих развитию гуморально-клеточных механизмов направленного действия, блокирующих жизненно важные функции паразита и обеспечивающих развитие иммунитета к последующему заражению.

Цель предлагаемого изобретения состоит в изыскании средства иммунизации, обеспечивающего развитие защитной иммунной реакции, предохраняющей от последующего заражения.

Сущность изобретения состоит в том, что защитный эффект против вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза) достигается инъекцией иммунопрепарата, включающего антигены клеточной культуры протосколексов Е.multilocularis (специфический компонент - далее "клеточный" антиген), количественный расчет которого проводится по содержанию белка, и риботана - нового комплексного иммуномодулятора. Белок в "клеточном" антигене определяли спктрофотометрически по Layne (1957).

"Клеточный" антиген представляет собой антигеноактивные метаболиты клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е.multilocularis и культивируемых в искусственных питательных средах с добавлением необходимых факторов роста для активной пролиферации клеток в культуре.

Способ получения "клеточного" антигена подробно описан (Бережко В.К. и др. "Способ получения диагностического антигена цестод", патент на изобретение №2219551). "Клеточный" антиген вызывает иммунный ответ у кроликов и реагирует с гомологичной антисывороткой, образуя в реакции иммунодиффузии в агаровом геле не менее 5-6 комплексов антиген-антитело в виде проявленных полос преципитации. Иммунизация кроликов "клеточным" антигеном совместно с риботаном активизировала иммунный ответ, что проявилось увеличением количества выявляемых комплексов антиген-антитело на 1-2 и более четкими полосами преципитации в агаровом геле при одинаковых количественных соотношениях антисыворотки и антигена, используемых в реакции иммунодиффузии.

Риботан - это соединение низкомолекулярных (0,5-1,0 кДа) полипептидов и низкомолекулярных фрагментов РНК. Этот препарат относится к группе иммуномодуляторов природного происхождения и оказывает действие на Т- и В-систему иммунитета, стимулирует иммунореактивность к специфическому антигену, функциональную активность макрофагов, субпопуляции Т- и В-лимфоцитов, а также синтез интерферона и лимфокинов. Препарат используется в медицинской практике.

Непосредственно перед проведением экспериментов на животных-моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы "клеточного" антигена Е.multilocularis (по белку) в объемном выражении и смешивали с рассчитанной согласно инструкции дозой иммуномодулятора риботана. Полученный иммунопрепарат использовали для профилактики вторичного альвеолярного гидатидоза на животных-моделях.

Разовая иммунизирующая доза иммунопрепарата для мышей составляла 0,2 мл (80 мкг белка) "клеточного" антигена и 5 мкл риботана; для крыс - 0,45 мл (200 мкг белка) "клеточного" антигена и 50 мкл риботана.

Протективные свойства иммунопрепарата изучили на животных-моделях при 3-кратном подкожном введении с интервалом 10 дней и последующем проверочном заражении иммунизированных и контрольных животных инвазивным материалом Echinococcus multitocularis через 14 дней после последней иммунизации.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Протективные свойства иммунопрепарата ("клеточный "антиген + риботан) оценивали при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе (гидатидозе) на мышах.

Исследования провели на 48 белых беспородных мышах массой 16-18 г, распределенных на 4 равноценные группы (табл.1).

Первая группа мышей была иммунизирована подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней иммунопрепаратом из расчета 0,2 мл (80 мкг белка) "клеточного" антигена и 5 мкл риботана на мышь.

Вторая группа мышей получила подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней по 0,2 мл (80 мкг белка) "клеточного" антигена и 5 мкл стерильного физиологического раствора.

Третья группа мышей получила подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней по 0,2 мл стерильного физиологического раствора и 5 мкл риботана

Четвертая группа мышей (контроль) получила 3-кратно, подкожно с интервалом 10 дней по 0,2 мл стерильного физиологического раствора.

По истечении 14 дней мышей всех четырех групп заразили протосколексами и ацефалоцистами E.multilocularis в дозе 200±20 экз. Убой подопытных мышей провели на 70 день после заражения. Результаты эксперимента, представленные в табл.1, показали, что 11 мышей первой группы, иммунизированных иммунопрепаратом, оставались незараженными, у одной мыши обнаружены в печени единичные ларвоцисты, размером менее 1-1,5 мм без инвазивных элементов Е.multilocularis.

Таким образом, эффективность защиты составила 91,7%.

У мышей второй группы, иммунизированных только "клеточным" антигеном без риботана защитный эффект составил 75%, у трех мышей (25%) из 12 были также обнаружены в печени цисты паразита без зародышевых элементов.

Мыши третьей группы, иммунизированные только риботаном, в большинстве случаев (9 мышей) были заражены и имели многочисленные ларвоцисты в печени и в брюшной полости размером до 6-8 мм с наличием в некоторых из них зародышевых элементов альвеолярного эхинококка.

Мыши четвертой контрольной группы были все заражены, у них обнаружены многочисленные ларвоцисты во всех внутренних органах и в брюшной полости размером до 1,2 см в диаметре. В большинстве ларвоцист паразита регистрировали сформировавшиеся протосколексы.

Пример 2. Протективные свойства иммунопрепарата ("клеточный" антиген + риботан) при экспериментальном вторичном альвеолярном эхинококкозе (гидатидозе) на крысах.

Исследования провели на 36 белых беспородных крысах массой 180-200 г, распределенных на 4 равноценные группы.

Первая группа крыс была иммунизирована подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней иммунопрепаратом в дозе 0,45 мл (200 мкг белка) "клеточного" антигена и 50 мкп риботана/крысу.

Вторая группа крыс была иммунизирована 3-кратно подкожно с интервалом 10 дней только "клеточным" антигеном в дозе 0,45 мл (200 мкг белка) и 50 мкл стерильного физиологического раствора/крысу.

Третья группа крыс иммунизирована подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней в дозе 0,45 мл стерильного физиологического раствора и 50 мкл риботана/крысу.

Четвертая группа крыс (контроль) получила подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней по 0,5 мл стерильного физиологического раствора.

Через 14 дней после последней инъекции крыс всех четырех групп заразили инвазивным материалом (протосколексы, ацефалоцисты) Echinococcus multilocularis в дозе 600±50 экз.

Убой экспериментальных животных провели на 70-й день после заражения. Результаты вскрытия, представленные в табл.2, показали, что крысы первой группы, иммунизированные иммунопрепаратом, оставались незараженными, во внутренних органах и в брюшной полости ларвоцист E.multilocularis не обнаружили, т.е. иммунопрепарат проявил 100%-ный защитный эффект. У 7 крыс второй группы, иммунизированных только "клеточным" антигеном, ларвоцисты паразита также отсутствовали, у двух обнаружены ларвоцисты размером до 1,5-2 мм в диаметре, в которых зародышевые элементы отсутствовали. Защитный эффект составил 77,8%. Только у одной крысы из 9 в третьей группе, иммунизированных риботаном, ларвоцисты паразита отсутствовали, у 8-обнаружены ларвоцисты Е.multilocularis как в печени, так и в брюшной полости, размером от 1,2 до 15 мм в диаметре. В некоторых цистах крупных размеров регистрировали при микроскопировании сформировавшиеся протосколексы. Крысы четвертой контрольной группы все были заражены, во внутренних органах и в брюшной полости у них регистрировали множественные поражения размером от 2,5 до 25 мм в диаметре, в большинстве из которых обнаружены сформировавшиеся протосколексы, сохранившие свои инвазивные свойства, что было установлено последующей биопробой на мышах.

Источники информации

1. Бессонов А.С. // Ветеринария. - 2000. - №11. - с.3-6.

2. Маркин А.В. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - 1999. - с.152-154.

3. Мусаев Г.Х. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - 1999. - с.170-171.

4. Gottstein В., Muller N., Cryz S., Vogel M., Tanner J., Seebeck Т. // Parasite Immunol. - 1990. - V.12, №2. - Р.163-174.

5. Kovalenko F.P. et al. // Acta Parasitologica, VIII Europ. Microcolloquium of Parasitol. - 2002. - V.45, №3, - P.241-242.

6. Layne E. // Methods Enzymol. - 1957. - V.3 - Р.447-454.

7. Rau M.E, Tanner C.E. // Nature, London. - 1975. - V.256, №5515. - P.318-319.

8. Reuben J.M., Tanner C.E // Short. Commun., Warszawa. - 1978. - Sec E. - P.51-52.

9. Reuben J.M., Tanner C.E., Rau M.E. // Infect and Immun. - 1978. - V.21, №1. - P.135-139.

10. Reuben J.M., Tanner C.E // Parasite Immunol. -1983. - V.5, №1. - P.61-66.

11. Thompson R.C. // Z. Parasitenk. - 1976. - V.21, №1. - S.31-36.

Табл.1.Результаты оценки протективных свойств иммунопрепарата ("клеточный" антиген Е. multilocularis + риботан) при вторичном альвеолярном гидатидозе у мышей.Номера группКоличество мышей в группеИммунизирующее средствоИммунизирую щая доза, мкг белкаКратность иммунизацииИнтервал между иммунизациями, дниДоза заражения, экз.Количество заразившихся мышей, %Эффективность защиты, %ПримечаниеI12Иммунопрепарат80310200±201 (8,3)91,7У одной мыши обнаружены единичные ларвоцисты в печени диаметром 1-1,5 мм без инвазивных элементов.II12"клеточный" антиген + физ. раствор80310200±203 (25)75У 3 мышей в печени обнаружены ларвоцисты альвеолярного эхинококка до 1,5 мм в диаметре, зародышевые элементы отсутствуют.III12Риботан + физ. раствор-310200±209 (75)25У 9 мышей регистрировали многочисленные ларвоцисты до 8 мм в диаметре с зародышевыми элементами Е. multilocularisIV12Физиологический раствор-310200±2012 (100)-Все мыши заражены, обнаружены многочисленные ларвоцисты 1,5-12 мм в диаметре во внутренних органах и в брюшной полости с наличием протосколексов.

Табл.2.Результаты оценки протективных свойств иммукопрепарата ("клеточный" антиген Е.multilocularis + риботан) при вторичном альвеолярном гидатидозе у крыс.Номера группКоличество крыс в группеИммунизирующее средствоИммунизирующая доза, мкг белкаКратность иммунизацииИнтервал между иммунизациями, дниДоза заражения экзКоличество заразившихся крыс, %Эффективность защиты, %ПримечаниеI9"клеточный" антиген + риботан200310600±50-100Крысы не заражены. Во внутренних органах и в брюшной полости ларвоцисты не обнаружены.II9"клеточный" антиген + стерильный физ. раствор200310600±502 (22,2)77,8Заразились две крысы, обнаружены у них ларвоцисты до 2 мм в диаметре, зародышевые элементы отсутствуют.III9Риботан + стерильный физ. раствор-310600±508 (88,8)11,2У 8 крыс обнаружены многочисленные ларвоцисты как в печени, так и в брюшной полости, от 1,2 до 15 мм в диаметре, в некоторых регистрировали протосколексы паразитаIV9Стерильный физиологический раствор-310600±509 (100)-Все крысы заражены, у всех обнаружены многочисленные ларвоцисты во внутренних органах и в брюшной полости от 2,5 до 25 мм в диаметре, в большинстве обнаружены сформировавшиеся протосколексы.

Таблица 3Результаты оценки протективных свойств "клеточного" антигена (КлАГ) протосколексов Echinococcus multilocularis в комплексе с риботаном (Р) при вторичном альвеолярном гидатидозе на кроликах№ ппК-во кроликов в гр.Иммунизирующее средствоИммунизирующая доза, мкгкратность иммуниз., дн.Интервал между иммуниз., дн.Доза заражения, экз.Кол-во заразившихся ж-х, %Эффективность защиты, %ПримечаниеI9КлАГ + Р300,0310600±501 (11,1%)88,9%У одного кролика обнаружены мелкие, единичные ларвоцисты в печени 1,0-1,5 мм в диаметре без инвазивн. элементов.II9КлАГ + физ. р-р300,0310600±504 (44,4%)55,6%У 4 кроликов обнаружены ларвонисты 1,5-2,5 мм в диаметре, зародышевые элементы отсутствуют.III6Риботан + физ. p-p15 мкл + 0,3 мл310600±504 (66,7%)32,3%У 4 кроликов регистрировали в брюшной полости и в печени многочисленные ларвоцисты эхинококка с зародышевыми элементами.IV6Физ. р-р0,3 мл310600±506 (100%)-Все кролики заражены, обнаружены многочисленные ларвоцисты до 16-25 мм в диаметре, в брюшной полости и во внутренних органах, в большинстве из них протосколексы паразита.

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии. Способ включает введение клеточной культуры из протосколексов Echinococcus multiocularis, смешанной с риботаном в эффективных количествах, трехкратно подкожно с интервалом 10 дней. Способ эффективен при профилактике вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза). 3 табл.

Способ профилактики вторичного альвеолярного эхинококкоза (гидатидоза) животных, заключающийся в том, что антиген клеточной культуры из протосколексов Echinococcus multiocularis смешивают с риботаном в эффективных количествах и вводят животным трехкратно подкожно с интервалом 10 дней.