СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИМАГИНАЛЬНОГО АЛЬВЕОКОККОЗА Российский патент 2007 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к ветеринарной и медицинской гельминтологии, и может быть использовано для воспроизведения лабораторной модели имагинального альвеолярного эхинококкоза (альвеококкоза), пригодной для изучения взаимоотношений хозяин-паразит, скрининга средств профилактики и лечения кишечных цестодозов животных и человека, а также в качестве продуцента антигенного паразитарного материала для нужд биотехнологии в разработке и производстве специфических вакцин и диагностических тест-систем.

Проблема профилактики и лечения цистного и альвеолярного имагинальных эхинококкозов собак - главного источника заражения людей и сельскохозяйственных животных ларвальными эхинококкозами, до настоящего времени остается актуальной, так как методы профилактики имагинальных эхинококкозов еще не разработаны, а известные методы лечения этих инвазий основаны на применении химических препаратов, лишенных овицидной активности.

В экспериментах по разработке методов профилактики и лечения имагинальных эхинококкозов используются экспериментально зараженные естественные дефинитивные хозяева паразитов - собаки и кошки, работа с которыми сопряжена с риском заражения экспериментаторов и обслуживающего персонала ларвальными эхинококкозами, загрязнения окружающей среды высокоустойчивым к воздействию внешних факторов патогенным для человека инвазионным материалом (яйцами эхинококка), с необходимостью в специальном оборудовании режимной лаборатории и большими финансовыми затратами.

Попытки заменить в этих исследованиях собак и кошек мелкими лабораторными грызунами с целью снижения степени опасности и затратности опытов привели к созданию экспериментальной модели имагинального альвеококкоза, которая воспроизводится у молодых золотистых хомяков путем орального заражения зрелыми протосколексами альвеококка и обработки зараженных животных кортикостероидом. В тонкой кишке иммуносупрессированных хомяков протосколексы приживаются и развиваются в стробилярном направлении до стадии формирования инвазионных яиц, что приближает модель имагинального альвеококкоза у золотистых хомяков по основному критерию (полному созреванию паразита) к соответствующей инвазии у естественных дефинитивных хозяев гельминта - собак и кошек (Ф.П.Коваленко, 1976; Ф.П.Коваленко и соавт., 1990; М.Kamiya, H.Sato, 1990).

Однако известная модель имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих ее надежность, удобство воспроизведения и поддержания, продуктивность в отношении антигенного паразитарного материала и повышающих ее трудоемкость: высокая смертность животных в результате токсического действия высокой суммарной дозы кортикостероида; низкая приживаемость стробил альвеококка в кишечнике хомяков в процессе роста и созревания паразитов; необходимость в многократных инъекциях кортикостероида для поддержания экспериментальной инвазии.

В качестве прототипа избрана работа М.Kamiya, H.Sato (1990), в которой описан следующий способ моделирования имагинального альвеококкоза. 11-ти золотистым хомякам - самцам в возрасте 6-ти недель при легком эфирном наркозе с помощью шприца и канюли вводили в желудок по 0,5 мл взвеси зрелых протосколексов, выделенных из ларвоцист альвеококка от экспериментально зараженной монгольской песчанки-донора. Доза инвазионного материала составляла 20000 протосколексов на 1 животное. Каждому хомяку вводили подкожно 1 раз в день по 5,0 мг преднизолона (суспензия Codelcortone® - Т.В.А., Merck&Co., Inc., Rahway, N.J., США) за 14 и 12 дней до заражения, в день заражения, на 2, 4, 6, 10, 14, 18 и 22-й дни после заражения протосколексами (всего 10 инъекций кортикостероида в суммарной дозе около 0,70 г/кг). Вскрытие каждого животного проводили в день его гибели. При вскрытии извлекали тонкую кишку, разделяли ее на 3 равных фрагмента и помещали в чашку Петри с физиологическим раствором. Через несколько часов инкубации фрагменты разрезали вдоль, соскабливали с них слизистую оболочку вместе с гельминтами и подсчитывали в соскобах общее количество стробил альвеококка. При малом увеличении микроскопа определяли степень зрелости выявленных гельминтов. Созревание большинства стробил до стадии формирования эмбриофора у яиц в терминальной проглоттиде отмечено на 25-й день развития. Максимальное число проглоттид не превышало 3. К этому сроку выжили 3 (27,3%) хомяка. Максимальное число стробил в тонкой кишке хомяков достигало 1475 экз. на 1 животное (7,4% от числа введенных протосколексов). Подтверждение патогенности яиц альвеококка с помощью биологической пробы не проводилось.

Недостатками известной модели являются падеж большинства зараженных хомяков (72,7%) из-за токсического действия высокой суммарной дозы кортикостероида (0,7 г/кг) сопряжен с необходимостью увеличения количества животных в эксперименте, дополнительным расходом животных, инвазионного материала и кортикостероида, что повышает затратность модели, ограничивает ее надежность и пригодность для скрининга средств профилактики и лечения имагинальных эхинококкозов; низкая выживаемость стробил альвеококка (7,4%) исключает возможность применения модели в качестве продуцента ценного антигенного паразитарного материала для нужд биотехнологии и снижает надежность модели в экспериментальных исследованиях; необходимость в многократных инъекциях кортикостероида (10 инъекций) и анестезии животных при заражении повышают трудоемкость и затратность модели; использование монгольских песчанок в качестве доноров зрелых ларвоцист альвеококка ограничивает удобство и широкое применение модели ввиду малой доступности животных этого вида и их высокой мобильности; патогенность яиц альвеококка не подтверждена биологической пробой на восприимчивых к инвазии лабораторных животных, что ограничивает полноту объективной характеристики модели по наиболее важному критерию - полному созреванию паразита.

Задачей изобретения является создание способа моделирования имагинального альвеококкоза, обеспечивающего повышение выживаемости хозяина и паразитов, продуктивность модели в отношении паразитарного материала, снижение ее трудоемкости и затратности.

Предлагаемый способ основан на использовании двух впервые выявленных феноменов: 1) повышенных чувствительности к иммуносупрессивной активности и толерантности к токсическому действию кортикостероидов взрослых золотистых хомяков в отличие от молодых хомяков; 2) легкой переносимости взрослыми золотистыми хомяками экстремальной гиперинвазии имагинальным альвеококком при высокой приживаемости у них паразитов на фоне медикаментозной иммуносупрессии.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Взрослым золотистым хомякам обоего пола в возрасте 3-4 мес вводят в желудок по 50000-100000 зрелых протосколексов альвеококка. В день заражения каждому животному вводят подкожно гидрокортизон в дозе 0,13-0,15 г/кг. При контрольном вскрытии хомяков в разные сроки в течение 1 мес после заражения определяют число, локализацию и степень зрелости стробил альвеококка в тонкой кишке животных. Для каждого впервые использованного географического изолята альвеококка определяют однократно наиболее ранний срок созревания яиц в терминальной проглоттиде стробил альвеококка с точностью до 1 дня для контроля за патогенным инвазионным материалом. Инвазивность яиц в зрелых стробилах подтверждают биологической пробой на хлопковых крысах путем орального заражения животных зрелыми стробилами альвеококка и последующей регистрации наличия инвазии ларвальным альвеококком у зараженных крыс.

Благодаря отличительным признакам, приведенным в таблице, заявляемый способ имеет следующие преимущества перед способом-прототипа. Использование взрослых золотистых хомяков в возрасте 3-4 мес позволяет снизить суммарную дозу кортикостероида до нетоксичной (0,13-0,15 г/кг) без снижения целевого эффекта и тем самым полностью исключить падеж зараженных животных. Повышение дозы инвазионного материала (50-100 тыс. протосколексов) обеспечивает дополнительную стабильную биологическую иммуносупрессию, способствующую повышению приживаемости паразитов в кишечнике хомяков (до 59,9%), за счет легко переносимой животными экстремальной гиперинвазии просветной формой альвеококка (до 60 тыс. стробил на 1 животное). Совокупность этих признаков обеспечивает большую надежность модели, ее пригодность в экспериментальных исследованиях (изучение взаимоотношений хозяин-паразит, скрининг средств профилактики и лечения кишечных цестодозов животных и человека), повышение ее рентабельности и продуктивности в отношении ценного паразитарного антигенного материала для нужд биотехнологии (разработка и производство специфических вакцин и диагностических тест-систем). Сокращение количества инъекций кортикостероида до однократной и исключение анестезии животных при заражении повышают удобство модели, снижают ее трудоемкость и затратность. Использование вместо монгольских песчанок белых крыс в качестве доноров инвазионного материала обеспечивает большее удобство и широкое применение модели ввиду большей доступности животных этого вида для экспериментаторов, более легкой приручаемости и меньшей мобильности. Подтверждение патогенности яиц альвеококка биологической пробой на высоковосприимчивых к инвазии хлопковых крысах обеспечивает более полную объективную характеристику модели по наиболее важному критерию (созревание паразита до стадии формирования инвазионных яиц), приближающему ее к соответствующей инвазии у естественных дефинитивных хозяев паразита - собак и кошек.

Эффективность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 9-ти взрослым золотистым хомякам в возрасте 3 мес и массой тела 92-106 г вводили в желудок с помощью шприца канюли по 50000 зрелых протосколексов (в 2,5 мл физиологического раствора), выделенных из ларвоцист альвеококка от экспериментально зараженной белой крысы-донора. Поддерживаемый на белых крысах изолят альвеококка выделен на ларвальной стадии от оперированного больного, заразившегося в Тульской области России (Е.А.Chernikova et al., 2002). В день заражения каждому хомяку вводили подкожно по 14 мг гидрокортизона (микрокристаллическая суспензия ацетата гидрокортизона и гидрохлорида лидокаина, А.О.Гедеон Рихтер, Венгрия) в дозах 0,13-0,15 г/кг. Наблюдение за выживаемостью животных проводили в течение 1 мес после заражения. Контрольное вскрытие хомяков для определения наличия инвазии, количества, локализации и степени зрелости прижившихся в тонкой кишке стробил альвеококка проводили с 23-го по 30-й дни после заражения. При вскрытии извлекали тонкую кишку, разделяли ее на фрагменты длиной 1-1,5 см каждый и помещали в чашку Петри с физиологическим раствором, где фрагменты разрезали вдоль, соскабливали с них предметным стеклом слизистую оболочку вместе с гельминтами и подсчитывали количество стробил альвеококка в каждом соскобе. При малом увеличении микроскопа определяли степень зрелости паразитов. В течение 1 мес после заражения падежа животных не было. При вскрытии у всех хомяков отмечены выраженное увеличение диаметра всей тонкой кишки (в 1,5-2 раза по сравнению с нормой) и характерный молочно-белый ее цвет за счет экстремальной гиперинвазии стробилами альвеококка, число которых на 1 животное варьировало от 9794 до 21083 экз. (19,6-42,2% от числа введенных протосколексов). Созревание стробил до стадии формирования эмбриофора у яиц в терминальной проглоттиде отмечено на 26-й день развития. Число проглоттид у всех цестод не превышало двух. Длина гельминтов варьировала от 1 до 4 мм. Паразиты локализовались равномерно по ходу всей тонкой кишки. Число зрелых яиц в терминальной проглоттиде у цестод к 28-му дню развития колебалось от 18 до 86 экз. Патогенность яиц была подтверждена биологической пробой на 5-ти хлопковых крысах-самцах в возрасте 1,5-2 мес путем заражения каждого животного в желудок 10-ю зрелыми стробилами альвеококка в возрасте 28-ми дней. Через 3-4 мес после заражения оценивали результаты биопробы путем вскрытия крыс и определения у них массы и степени зрелости развившихся в печени паразитарных ларвоцист. У всех хлопковых крыс, вскрытых через 92-127 дней после заражения, выявлен первичный альвеококкоз печени. Печень животных была резко увеличена, большая часть ее паренхимы была замещена конгломератами созревающих и зрелых ларвоцист альвеококка, масса которых достигала 55-93% от массы тела животного.

Пример 2. 5 взрослых золотистых хомяков-самцов в возрасте 4 мес и массой тела 122-137 г заражали в желудок зрелыми протосколексами альвеококка. Доза инвазионного материала составляла 100000 протосколексов и была введена в два приема с интервалом между введениями в 4 часа. В день заражения каждому животному вводили подкожно по 17,5 мг гидрокортизона в дозах 0,13-0,14 г/кг. Штамм паразита, донор инвазионного материала и методика определения параметров модели имагинального альвеококкоза были такими же, как в примере 1.

Дополнительно исследовали соскобы слизистой оболочки желудка на наличие стробил альвеококка. В течение 1 мес после заражения падежа среди подопытных животных не было. Всех хомяков вскрывали через 30 дней после заражения. При вскрытии животных установлена экстремальная гиперинвазия зрелыми просветными формами альвеококка. Число стробил в тонкой кишке у хомяков колебалась от 18662 до 59948 экз. на 1 животное (18,7-59,9%) от числа введенных протосколексов. В антральном отделе желудка у одного хомяка выявлены 8 живых, подвижных, зрелых стробил альвеококка.

Пример 3. 12-ти золотистым хомякам обоего пола в возрасте 1,5 мес и массой тела 40-49 г вводили в желудок по 50 тыс. зрелых протосколексов альвеококка. В день заражения каждому животному вводили подкожно по 6,2 мг гидрокортизона (в дозах 0,13-0,15 г/кг). Штамм паразита, донор инвазионного материала и метод определения параметров модели имагинального альвеококкоза у хомяков были теми же, что и в примере 1. Павших животных вскрывали в день гибели, а выживших - через 29 дней после заражения. В течение 23-х дней после заражения пали 8 (66,7%) хомяков, в тонкой кишке которых обнаружено 378-2863 живых незрелых стробил альвеококка (0,7-5,7% от числа введенных протосколексов). При вскрытии остальных животных в тонкой кишке выявлено 73-418 живых стробил альвеококка (0,1-0,8% от числа введенных протосколексов), подавляющее большинство которых было представлено незрелыми формами. Число зрелых стробил (содержавших в терминальной проглоттиде покрытые эмбриофором яйца) не превышало 5,5-14,1% от общего числа паразитов у каждого животного.

Таким образом, предлагаемый способ моделирования имагинального альвеококкоза обеспечивает повышение выживаемости животных (100%) и паразитов (до 60%), продуктивности модели в отношении паразитарного материала (до 60000 стробил альвеококка на 1 животного), снижение трудоемкости (одна инъекция кортикостероида) и затратности, что выгодно отличает его от способа-прототипа, который характеризуется более низкой выживаемостью животных (27%) и паразитов (7%), меньшей продуктивностью в отношении паразитарного материала (до 1,5 тыс. цестод на 1 животное), бóльшими трудоемкостью (10 инъекций кортикостероида) и затратностью.

Источники информации

1. Коваленко Ф.П. Выживаемость протосколексов альвеококка и эхинококка в кишечнике лабораторных грызунов. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 1976. - №3. - С.350-352.

2. Коваленко Ф.П., Разаков Ш.А., Хакбердиев П.С., Аминжанов М., Збарский А.И, Баллад Н.Е. Экспериментальный имагинальный многокамерный эхинококкоз золотистых хомяков. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 1990. - №6. - С.41-43.

3. Chernikova E.A., Kovalenko F.P., Legonkov Yu.A., Musaev G.H., Bessonov A.S., Gorovaya N.S. Susceptibility of laboratory rodents to parenteral infection by Echinococcus multilocularis larval cysts of human origin. Xth International Congress of Parasitology, 4-9 August 2002, Vancouver, Canada. ICOPA X Abstracts, 2002, P.300-301.

4. Kamiya М., Sato H. Survival, strobilation and sexual maturation of Echinococcus multilocularis in the small intestine of golden hamsters // Parasitology. - 1990. - V.100. - P.125-130.

ТаблицаСравнение отличительных признаков способов моделирования имагинального альвеококкоза прототипа и заявляемогоОтличительный признакСпособпрототипазаявляемыйВозраст золотистых хомяков к моменту заражения, недели612-16Пол животныхсамцыобоего полаАнестезия животных при заражениипроводиласьне проводиласьДоза инвазионного материала (число протосколексов альвеококка на 1-го хомяка, тыс.)2050-100Донор инвазионного материаламонгольская песчанкааутбредная крысаКортикостероид - иммунодепрессантпреднизолонгидрокортизонЧисло инъекций кортикостероида101Суммарная доза кортикостероида, г/кг0,70,13-0,15Выживаемость хомяков к сроку созревания паразитов, % от числа зараженных животных27,3100Максимальная выживаемость стробил альвеококка к сроку их созревания, % от числа введенных протосколексов7,459,9Максимальное число зрелых стробил альвеококка в кишечнике зараженных хомяков147559948Подтверждение патогенности яиц альвеококка биологической пробойне проводилосьпроводилосьПригодность модели для скрининга средств профилактики и лечения имагинальных эхинококкозов и других кишечных цестодозовнепригодна ввиду низкой выживаемости хозяина и паразитапригоднаПригодность модели в качестве продуцента специфического паразитарного антигенного материала для нужд биотехнологии (разработка и производство диагностических тест-систем и вакцин)непригодна ввиду низкой продуктивности в отношении паразитарного материалапригодна

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии и может быть использовано для моделирования имагинального альвеококкоза. Для этого заражают золотистых хомяков в возрасте 3-4 месяцев введением в желудок зрелых протосколексов альвеококка в дозе 50-100 тыс. А также парентерально вводят животным кортикостероид в дозе 0,13-0,15 г/кг однократно в день заражения. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели при повышении выживаемости хозяина и паразитов, а также снижение ее трудоемкости и затратности. 1 табл.

Способ моделирования имагинального альвеококкоза, включающий заражение золотистых хомяков в желудок зрелыми протосколексами альвеококка и парентеральное введение животным кортикостероида, отличающийся тем, что животных используют в возрасте 3-4 месяцев, доза инвазионного материала составляет 50-100 тыс. протосколексов, а кортикостероид вводят в дозе 0,13-0,15 г/кг однократно в день заражения.