СПОСОБ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК К ЛИЗИСУ, ОПОСРЕДОВАННОМУ КЛЕТКАМИ-КИЛЛЕРАМИ Российский патент 2000 года по МПК A61K31/01 A61K35/55 A61K38/19 

Настоящее изобретение относится к лечению рака путем сенсибилизации раковых клеток антиэстрогенами к лизису клетками-киллерами, в частности естественными клетками-киллерами (ЕКК), лимфокинактивированными клетками-киллерами ЛАКК) и цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ).

Попытки лечения рака человека аутологическими лимфокинактивированными клетками-киллерами (ЛАКК) в сочетании с рекомбинантным лимфокином и инторлейкином-2 уже предпринимались и принесли обнадеживающие результаты (Rosenberg, 1987), так же, как попытки лечения активированными цитоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) (Fujimoto, 1992).

Нестероидные антиэстрогены тамоксифен и торемифен, относящиеся к классу трифенилэтилена, получили широкое распространение при лечении эстрогенположительного рака молочной железы. Тамоксифен и торемифен ингибируют эстрогениндуцированный рост путем конкурентного антагонизма по отношению к эстрогеновым рецепторам опухоли. Антиэстрогенная терапия является эффективной в пролонгировании периода без заболевания и общего выживания женщин посло первичного хирургического вмешательства. Другими хорошо известными антиэстрогенами класса трифенилэтилена являются например, кломифен и дролоксифен (3-гидрокситамоксифен).

В настоящее время мы обнаружили, что раковые клетки, не имеющие эстрогеновых рецепторов, сенсибилизируются антиэстрогенами класса трифенилэтилена к лизису эффекторами ЕКК, ЛАКК и ЦТЛ. Таким образом, этот сенсибилизирующий эффект не зависит от присутствия классических рецепторов эстрогенов. Ожидается, что применение комбинации антиэстрогенового лечения и терапии клетками-киллерами, согласно настоящему изобретению, значительно повысит процент опухолевой ремиссии и излечения, что уже достигалось авторами настоящего изобретения при использовании только клеток-киллеров у небольшого количества пациентов.

Резюме
Настоящее изобретение относится к способу сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, который включает в себя введение пациенту эффективного количества антиэстрогена и клеток-киллеров совместно или последовательно; клетки-киллеры выбирают из группы ЕКК, ЛАКК и ЦТЛ, а антиэстроген выбирают из антиэстрогенов класса трифенилэтилена, таких как тамоксифен или торемифен или их фармацевтически приемлемые соли. При другом варианте образование клеток-киллеров может быть индуцировано у пациента одним из известных иммуностимулирующих способов в течение первого периода лечения, после чего вводится эффективное количество антиэстрогена в течение второго периода лечения.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой график исследования Уинна с необработанными, обработанными тамоксифеном (ТКС) и обработанными торемифеном (ТО) клетками опухоли Р815.

Фиг. 2a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 1.

Фиг. 3 представляет график воздействия перорального приема ТКС и ТО в отдельности или с лечением ЛАКК на рост опухоли Р815.

Фиг. 4a, b и с представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 3.

Фиг. 5 представляет график исследования Уинна с необработанными, обработанными тамоксифеном (ТКС) и обработанными торемифеном (ТО) клетками опухоли Р815.

Фиг. 6a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 5.

Фиг. 7 представляет график, иллюстрирующий результаты иммунотерапии мастоцитомы Р815 ТКС или ТО и ЛАКК.

Фиг. 8a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 7.

Фиг. 9 представляет график, иллюстрирующий результаты иммунотерапии мастоцитомы Р815 ТКС или ТО, вводившихся через желудочный зонд, и ЛАКК.

Фиг. 10a, b и c представляют кривые выживания для эксперимента фиг. 9.

1. Выявление клеток-киллеров
Непременным условием успеха лечения согласно настоящему изобретению является наличие клеток-киллеров (например, ЕКК, ЛАКК или ЦТЛ), способных разрушать раковые клетки в организме пациента, к моменту начала дополнительной терапии антиэстрогеном, например тамоксифеном (ТКС) или торемифеном (ТО). В идеале клеточная суспензия должна быть приготовлена из опухоли пациента посредством воздействия коллагеназы, как описано Freshney (1976), и использована в качестве клеток-мишеней. Некоторые из клеток-мишеней затем подвергают предварительной обработке в течение 4 часов ТКС или ТО, а остальные оставляют необработанными, и оба препарата метят ⁵¹Cr. Мононуклеарные клетки периферической крови пациента, очищенные от ненужных клеток, используют в исследовании высвобождения ⁵¹Cr в качестве эффекторов. Лишние опухолевые клетки можно хранить в культуральной среде, такой как RPM1-1640, в которую добавлено 10% сыворотки (предпочтительно, аутологической) и 10% диметилсульфоксида в жидком азоте, для использования в последующих процедурах. Если этот подход невыполним, в качестве мишеней можно использовать клеточные линии, такие как К652, подходящие для выявления активности ЕКК, или линии, выделенные из раковой опухоли того же типа другого человека. Наличие в биопсийном образце лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО), может служить показателем присутствия собственных клеток-киллеров. Дополнительными исследованиями, которые используются для выявления клеточного иммунитета и могут также применяться, являются: кожные реакции гиперчувствительности замедленного типа, вызванные экстрактом опухолевого антигена; ингибирование миграции периферических лейкоцитов экстрактом опухолевого антигена и пролиферативная реакция CD8 + T-лимфоциты на экстракт опухолевого антигена.

Как только с помощью какой-либо из вышеназванных методик удается установить, что собственные клерки-киллеры пациента способны убивать клетки его опухоли, необходимо начинать терапию антиэстрогенами, пока не будет достигнута регрессия опухоли. Если клетки-киллеры не выявлены, их образование должно быть индуцировано в организме методами иммуностимуляции или снижения тяжести опухолевого поражения, как описано ниже.

2. Снижения тяжести опухолевого поражения
Большинство пациентов с тяжелыми опухолевыми поражениями не имеют циркулирующих клеток-киллеров, которые можно обнаружить. Поэтому первой задачей терапии является снижение тяжести опухолевого поражения, если это возможно, путем хирургического вмешательства, облучения или химиотерапии. Множество экспериментов на животных и наблюдений пациентов свидетельствует о том, что снижение тяжести опухолевых поражений часто приводит к появлению клеток-киллеров как в циркулирующей крови, так и в самой опухоли. Как только клетки-киллеры обнаруживаются, необходимо начинать терапию антиэстрогенами.

3. Иммуностимуляция
Если снижение тяжести опухолевых поражений не привело к спонтанному появлению в организме пациента клеток-киллеров, можно предпринять попытку стимуляции появления этих клеток. Ниже перечислены некоторые из подходов к этой проблеме, которые могут быть использованы.

(a) Вакцинация.

(b) Лечение циклофосфамидом, который ингибирует супрессорные иммунные механизмы и усиливает, таким образом, клеточный иммунитет. Подобно этому, индометацин препятствует супрессорной функции макрофагов.

(с) Применение цитокинов, таких как интерлейкин-2.

(d) Применение адъювантов, стимулирующих клеточный иммунитет, таких как мурамилпептид и синтетические аналоги бактериальной стенки (Utsygi и др., 1991).

(c) Применение пищевых, факторов, таких как витамин A (Gergely и др., 1988).

Подходящие процедуры вакцинации описаны Livingston, 1992; Chang и др., 1993, и Hoover и др., 1993. Лечение циклофосфамидом описано, например, Kamatsumoto и др. , 1991 и Kassabov и Stoychkov, 1991. Лечение индометацином описано, например, Saarloos и др., 1993 и Aso и др., 1992.

Обычная терапевтическая доза циклофосфамида составляет 50 мг ежедневно, для индометацина - также 50 мг ежедневно. Цитокины, такие как интерлейкин-2 (ИЛ-2), также могут применяться для иммуностимуляции, как описано, например, Yoshino и др. , 1991. Yoshino и др. лечили пациентов малыми дозами ИЛ-2 (2•10⁶ японских единиц подкожно вначале, со снижением дозы наполовину в каждый последующий день, в течение 6 дней), что приводило к значительной активации ЕКК и ЛАКК.

Как только достигнуто индуцирование клеток-киллеров, необходимо начинать сенсибилизацию мишеней путем терапии антиэстрогенами.

4. Совместная терапия клетками-киллерами
Введение активированных in vitro ЕКК, ЛАКК или ЦТЛ и антиэстрогена совместно или последовательно также находится в пределах рамок настоящего изобретения. Антиэстроген выбирают из группы трифенилэтилена. Предпочтительными антиэстрогенами являются тамоксифен или торемифен или их фармацевтически приемлемые соли. Наши эксперименты показали, что такая комбинированная терапия имеет определенные преимущества по сравнению с лекарственными средствами или лечением клетками-киллерами по отдельности. Согласно нашим экспериментам, сенсибилизацию клеток-мишеней оптимально предпринимать на стадии, когда клетки-киллеры уже вырабатываются пациентом или же когда клетки-киллеры применяют совместно с лекарственными средствами.

Для воспроизводства ЛАКК мононуклеарные лимфоциты пациента культивируют с интерлейкином-2. Мононуклеарные лимфоциты собирают, как описано Rosenberg и др. , 1987. С помощью этой методики у пациента можно изъять от 1•10⁸ до 1•10¹¹ мононуклеарных клеток. Затем лимфоциты можно отделить от ненужных клеток с помощью известных методик. Полученные мононуклеарные лимфоциты культивируют в любой подходящей среде, такой как RPM1-1640, с добавлением рекомбинантного интерлейкина-2 человека, например, при 37^oC в течение 3-5 дней. Полученные ЛАКК выделяют и суспендируют в среде, подходящей для внутривенного введения пациенту. ЛАКК вводят предпочтительно один раз каждый день или через день от одной до пяти дневных доз. Предпочтительно вводить от 1•10⁸ до 1•10¹⁰ ЛАКК один раз в три дня в течение периода времени от 3 до 10 дней.

Состояние пациента может потребовать от одной до четырех таких схем последовательно. Этим же способом можно вводить ЕКК и ЦТЛ. Дополнительное руководство по терапии ЕКК и ЦТЛ можно найти в публикациях Rosenberg и др. (1987) и Fujimoto (1992).

В терапии согласно настоящему изобретению можно использовать дозы и схемы лечения ТКС и ТО, применяемые в настоящее время. Для ТКС подходящей пероральной дозой является 20-40 мг, которые дают ежедневно (Anderson и др., 1981). Для TO подходящей пероральной дозой является 40-60 мг, но может достигать 240 мг ежедневно (Hietanen и др., 1990). Предпочтительно начинать терапию антиэстрогенами, как только клетки-киллеры начнут воспроизводиться или введены в организм пациента. Терапия антиэстрогенами и терапия клетками-киллерами затем продолжается совместно, в оптимальном варианте, до полного излечения пациента. В пределах рамок настоящего изобретения находится также последовательная терапия антиэстрогенами и терапия клетками-киллерами, т. е. , когда терапия клетками-киллерами начинается немедленно после прекращения терапии антиэстрогенами. Однако совместная терапия предпочтительнее.

Заключая, можно сказать, что предпочтительной является следующая процедура лечения ТКС или ТО для усиления клеточной защиты организма:
(a) Выполнение исследований по выявлению клеток-киллеров в организме пациента;
(b) Если клетки-киллеры в организме пациента отсутствуют, их появление индуцируют известными способами, или
(c) клетки-киллеры воспроизводят in vitro и внутривенно вводят пациенту;
(d) Дополнительная терапия ТКС или ТО начинается, как только клетки-киллеры воспроизведены организмом пациента или введены ему внутривенно, предпочтительно, после определения сенсибилизирующего воздействия этих препаратов на клетки-мишени, т.е. лизиса клеток-мишеней эффекторными клетками;
(e) Во время терапии сенсибилизирующими препаратами тщательно следят за ее эффективностью.

Способ терапии настоящего изобретения можно различным образом модифицировать, не отступая от идеи настоящего изобретения и не выходя за его рамки. Варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, служат целям иллюстрации и не должны истолковываться как ограничительные.

Пример 1
Изучалось воздействие торемифена (ТО) и тамоксифена (ТКС) на лизис клеток-мишеней естественными клетками-киллерами (ЕКК), лимфокинактивированными клетками-киллерами (ЛАКК) и цитотоксическими T-лимфоцитами (ЦТЛ). Клетки крысиной селезенки использовали в качестве эффекторных клеток без активации (ЕКК) или после обработки ИЛ-2 человека (ЛАКК) или после стимуляции крысиной лимфой Nb2 в смешанных культурах (ЦТЛ). В качестве клеток-мишеней для ЕКК использовали клетки мышиной лимфомы Уac-1, для ЛАКК - клетки мастоцитомы Р815 и для ЦТЛ - клетки Nb2. Клетки-мишени и клетки-эффекторы предварительно обрабатывали ТО и ТКС в концентрациях от 1 нМ до 5 μM, в течение 4 часов, а затем отмывали. Клетки-мишени метили ⁵¹Cr в течение 1 часа, затем отмывали. Специфическое высвобождение ⁵¹Cr определяли спустя 4 часа инкубирования при 37^oC с 5% CO₂ (мишень/эффектор 1:25). Результаты представлены в таблицах 1-3 и свидетельствуют о том, что ТО и ТКС усиливали лизис клеток-мишеней дозозависимым образом посредством ЕКК, ЛАКК или ЦТЛ, если клетки-мишени обрабатывали в течение 4 часов до цитотоксической реакции. Предварительная обработка клеток-эффекторов не имела такого усиливающего эффекта, но эффекторы, обработанные ТО или ТКС, лизировали обработанные мишени так же эффективно, как и необработанные эффекторы.

Пример 2
Для воспроизводства ЛАКК 2•10⁶ /мл клеток селезенки самок мышей DBA/2 культивировали в течение 5 дней на среде RPM1-1640 с 10% СПК, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола и 500 ЕД/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека при 37^oC, в увлажненном воздухе, содержавшем 5% CO₂. Полученные ЛАКК убивали в отношении 1:25 10% клеток P815, 52% обработанных тамоксифеном (TKC) 1 μM, 4 часа) и 51% обработанных торемифеном (TO) 5 μM, 4 часа) клеток в исследовании с ⁵¹Cr. Те же эффекторные клетки затем смешивали с теми же не обработанными или обработанными лекарственными препаратами клетками Р815 в соотношении 1: 25 (мишень/эффектор) и подкожно инъецировали сингенным DBA/2 реципиентам (исследование Уинна). Использовали группы из 4 самок, а за ростом опухоли следили, пока все контрольные животные не погибали от новообразования. Другие детали эксперимента и размеры опухолей представлены на фиг. 1, в который включены только животные, у которых развилась опухоль. Кривые выживания представлены на фиг. 2a, b и c.

Как видно из этих результатов, лечение отдельно лекарственными препаратами и отдельно ЛАКК вызывало некоторое ингибирование опухоли, а при использовании совместно лекарственных препаратов и клеток-эффекторов ингибирование опухоли усиливалось. Например, от опухолевых клеток, подвергавшихся воздействию ТКС или ЛАКК, погибли все животные, в то время как одно животное оказалось защищенным в группе ТКС+ЛАКК. Предварительное лечение ТО защитило 1 из 4 животных, в то время как ТО + ЛАКК защитило 2 из 4 животных. Также из фиг. 1 ясно, что в группах лекарственный препарат + ЛАКК наблюдалась выраженная задержка опухолевого роста между 17 и 23 днями.

Пример 3.

В предыдущем эксперименте опухолевые клетки подвергались лишь кратковременному воздействию лекарственного препарата (4 часа) и ЛАКК, что объясняет ограниченную задержку роста опухоли в раннем периоде у тех животных, у которых в конечном счете выросла опухоль. В следующем эксперименте основная методика была той же, но лекарственный препарат давали с питьевой водой (ТКС, 100 μг/мл и ТО, 400 μг/мл), начиная двумя днями раньше прививки опухоли и в продолжении всего времени эксперимента. И снова, некоторые группы получали клетки опухоли, смешанные с ЛАКК в отношении 1:25, и затем те же дозы ЛАКК, инъецированных в место опухоли раз в неделю в течение 3 недель. Как можно видеть из фиг. 3, наблюдалось значительное ингибирование опухоли у животных, леченных только лекарственным препаратом, и у животных, получавших только ЛАКК. Рост опухоли также был самым медленным в тех группах, которые получали совместно лекарственный препарат и ЛАКК. Помимо этого, как видно из фиг. 4a, b и c, в группе ТКС + ЛАКК, а также в группе ТО и группе ТО + ЛАКК было по одному животному, у которых не развилась опухоль. Следовательно, продолжительным лечением мы добились успеха в виде значительного замедления роста опухолей, хотя доля животных, у которых опухоль не развилась, не возросла.

Пример 4
Повторили эксперимент примера 2 с увеличенным количеством ЛАКК (соотношение 1:50), смешанных с обработанными лекарственным препаратом и не обработанными опухолевыми клетками и введенных подкожно животным. Результаты представлены на фиг. 5. Кривые выживания представлены на фиг. 6a, b и c. Снова, как в предыдущих экспериментах, в леченных группах было несколько животных с неразвившимися опухолями, особенно в тех, где лекарственное лечение сочеталось с введением клеток-киллеров.

Пример 5
В этом иммунотерапевтическом эксперименте все группы получали ту же дозу опухолевых клеток подкожно, а спустя 12 дней, когда опухоль у всех животных отчетливо пальпировалась, начиналось лечение лекарственными препаратами в питьевой воде. Лечение ЛАКК начинали спустя 2 дня, которые вводили 3 раза с интервалом в 4 дня, как указано на фиг. 7. Лечение лекарственными препаратами продолжали в течение всего эксперимента. Как видно из фиг. 7, рост опухолей значительно задерживался лекарственным лечением в сочетании с клетками-киллерами. Это также отражено в кривых выживания, представленных на фиг. 8a, b и c. Все контрольные животные погибли от новообразования к 26 дню, в то время как все животные в группе ТО + ЛАКК к 28 дню были живы. Наблюдалась одна тотальная регрессия в группе ТКС + ЛАКК и одна частичная регрессия в группе ТО + ЛАКК (объем опухоли уменьшился в 10 раз по сравнению с первоначальным).

Пример 6
Самкам мышей DBA/2 подкожно инъецировали 10⁴ опухолевых клеток Р815. Когда опухоли достигли приблизительно 0,5 см в диаметре, начали лекарственное лечение (ТКС или ТО, 10 мг/кг в день через желудочный зонд). Спустя два дня интраперитонеально вводили 25•10⁴ ЛАКК, затем ЛАКК инъецировали еще три раза с интервалами в 4 дня. Лекарственное лечение продолжали с 14 по 30 день. Результаты представлены на фиг. 9. Снова рост опухоли значительно задерживался лекарственным лечением в сочетании с клетками-киллерами. Кривые выживания представлены на фиг. 10a, b и c. Наблюдали одну тотальную регрессию в группе ТКС + ЛАКК и одну частичную регрессию в группе ТО + ЛАКК (объем опухоли уменьшился в 10 раз по сравнению с первоначальным). Помимо этого, наблюдали по одному случаю регрессии в группах ТКС и ТО.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, и продукту. Способ включает в себя введение пациенту эффективного количества антиэстрогена и клеток-киллеров совместно или последовательно, причем клетки-киллеры выбирают из группы клеток ЕКК, ЛАКК и ЦТЛ, а антиэстроген выбирают из группы антиэстрогенов класса трифенилэтилена, таких как тамоксифен, или торемифен, или их фармацевтически приемлемые соли. Способ позволяет замедлить рост опухоли. 3 с. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл., 10 ил.

1. Способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, который включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком воздействии, эффективного количества антиэстрогена и клеток-киллеров совместно или последовательно, причем клетки-киллеры выбирают из группы естественных клеток-киллеров (ЕКК), лимфоактивированных клеток-киллеров (ЛАКК) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), а антиэстроген выбирают из группы трифенилэтиленовых антиэстрогенов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки-киллеры вводят в количестве от 1 • 10⁸ до 1 • 10¹⁰ клеток в день. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что трифенилэтиленовым антиэстрогеном является тамоксифен, или торемифен, или их фармацевтически приемлемые соли. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что тамоксифен или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально в дневной дозе 20 - 40 мг. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что торемифен или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально в дневной дозе 40 - 240 мг. 6. Способ сенсибилизации раковых клеток к лизису, опосредованному клетками-киллерами, который включает индуцирование образования клеток-киллеров в организме пациента с помощью одного из известных иммуностимулирующих методов в течение первого периода лечения и затем введение эффективного количества трифенилэтиленового антиэстрогена в течение второго периода лечения. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что трифенилэтиленовым антиэстрогеном является тамоксифен, или торемифен, или их фармацевтически приемлемые соли. 8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что иммуностимулирование осуществляется посредством введения интерлейкина-2. 9. Продукт для сенсибилизации раковых клеток для лизиса, опосредованного клетками-киллерами, в качестве комбинированного препарата, содержащий антиэстроген класса трифенилэтилена, клетки-киллеры, которыми являются ЕЕК, ЛАКК, или ЦТЛ клетки, и/или иммуностимулирующий агент. 10. Продукт по п.9, отличающийся тем, что антиэстрогеном трифенилэтиленового класса является антиэстроген, определенный в пп.3, 4 или 5, и иммуностимулирующим агентом является, если присутствует, интерлейкин-2. 11. Продукт по п.9, отличающийся тем, что содержит клетки-киллеры в количестве от 1 • 10⁸ до 1 • 10¹⁰. 12. Продукт по п.9, отличающийся тем, что содержит тамоксифен в количестве 20 - 40 мг. 13. Продукт по п.9, отличающийся тем, что содержит торемифен в количестве 40 - 240 мг.