ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫЙ ШТАММ "Н" ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДУКТОРА ИНТЕРФЕРОНА Российский патент 2000 года по МПК C12N7/00 A61K38/21 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается получения холодоадаптированного штамма "H" вируса болезни Ньюкасл, используемого для получения человеческого лейкоцитарного интерферона.

Известен штамм "H" вируса болезни Ньюкасл с оптимумом размножения при температуре (37±0,5)^oC, который используется в качестве индуктора в производстве человеческого лейкоцитарного интерферона. Для получения производственного штамма заражающую дозу маточного вируса, равную 10⁴ ЦПД/50/мл вводят по 0,2 мл в аллантоисную полость развивающихся 9-10 дневных куриных эмбрионов и инкубируют их в течение 48 часов при температуре (37±0,5)^oC. После последующего охлаждения при 4^oC вируссодержащую аллантоисную жидкость отсасывают, подвергают очистке и концентрации и используют ее в качестве вируса-индуктора. Полученная этим способом вируссодержащая аллантоисная жидкость имеет гемагглютинирующую активность до 128 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) в 1 мл, инфекционный титр в куриных эмбрионах не ниже 10⁸ ЦПД/50/мл. Используемый в дозе 2 - 7 ГАЕ на лейкоцит, вирус- индуктор позволяет получать препарат человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-типа с противовирусной активностью 8 000 10 000 МЕ/мл (1).

Недостатком используемого производственного штамма является высокое повреждающее действие на лейкоциты человека в процессе биосинтеза интерферона, что вызывает гибель до 40% клеток-продуцентов, в результате чего получаемый интерферон имеет нестабильные значения титров противовирусной активности.

Задачей изобретения является получение холодоадаптированного штамма "H" вируса болезни Ньюкасл, обладающего низким повреждающим действием на лейкоциты человека, что снижает процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции до 25%.

Сущность изобретения: штамм "H" вируса болезни Ньюкасл (ГКВ N 2348) селекционирован в процессе культивирования (19 пассажей) в развивающихся куриных эмбрионах при температуре 31,5-32,5^oC, что придало ему температурочувствительность и холодоадаптированность. Селекционированный штамм "H" (ГКВ 2348) вируса болезни Ньюкасл характеризуют: гемагглютинирующая активность 256 ГАЕ/мл, инфекционный титр 10¹¹ ЦПД/50/мл, низкое повреждающее действие в лейкоцитах человека. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков, т.е. не меняет свойств при последующих 5 пассажах в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32^oC.

Морфологическая структура вируса соответствует парамиксовирусам, имеет сферическую форму.

Предлагаемый штамм "H" (ГКВ 2348) снижает процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции до 25%.

Пример 1. Вирус маточного штамма "H" болезни Ньюкасл пассировали 19 раз при пониженной до 32^oC температуре. Полученный вирус приобрел признаки температурочувствительности и холодоадаптированности. Для получения производственного штамма берут 9-10-дневные куриные эмбрионы в количестве 100 шт. Шприцем вводят в аллантоисную полость каждого эмбриона по 0,1 мл жидкой вирусной суспензии, содержащей 10¹¹ ЦПД/50/мл холодоадаптированного вируса болезни Ньюкасл. Эмбрионы инкубируют в течение 48 часов при температуре 31,5^oC. После инкубации и охлаждения из эмбрионов отсасывают культуральную аллантоисную жидкость. Холодоадаптированный вариант вируса, полученный при культивировании в развивающихся куриных эмбрионах, при температуре 31,5^oC содержал 256 ГАЕ/мл. Инфекционный титр 10¹¹ ЦПД/50/мл. Вируссодержащую жидкость очищают микрофильтрацией и концентрируют.

Пример 2. Вирус маточного штамма "H" болезни Ньюкасл пассировали 19 раз при пониженной до 32^oC температуре. Полученный вирус приобрел признаки температурочувствительности и холодоадаптированности. Для получения производственного штамма берут 9-10-дневные куриные эмбрионы в количестве 100 шт. Шприцем вводят в аллантоисную полость каждого эмбриона по 0,1 мл жидкой вирусной суспензии, содержащей 10¹¹ ЦПД/50/мл холодоадаптированного вируса болезни Ньюкасл. Эмбрионы инкубируют в течение 48 часов при температуре 32,5^oC. После инкубации и охлаждения из эмбрионов отсасывают культуральную аллантоисную жидкость. Холодоадаптированный вариант вируса, полученный при культивировании в развивающихся куриных эмбрионах, при температуре 32,5^oC содержал 256 ГАЕ/мл. Инфекционный титр 10¹¹ ЦПД/50/мл. Вируссодержащую жидкость очищают микрофильтрацией и концентрируют.

Пример 3. Определение количества интерферона при использовании холодоадаптированного вируса-индуктора, полученного по примерам 1 и 2.

Суспендируют лейкоциты в 199 среде, содержащей необходимые добавки, и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора, полученный по примерам 1 и 2, из расчета 4,6 ГАЕ на 1 000 000 лейкоцитов. Взвесь инкубируют при 37^oC в течение 18-20 часов, постоянно перемешивая. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Выдерживают подкисленный полуфабрикат в течение 10 дней для инактивации вируса индуктора. Противовирусная активность полученного таким образом интерферона составляет 11 000 - 14 000 МЕ/мл.

Таким образом, получен штамм "H" вируса болезни Ньюкасл, с меньшим повреждающим действием на клетки-продуценты интерферона.

Селекционированный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д.И.Ивановского Академии медицинских наук. Штамму присвоен номер депонента ГКВ N 2348.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЙ ИСТОЧНИК
1. Регламент производства N 281-90. Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой, 1990 г.

Изобретение предназначено для получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Штамм "Н" вируса болезни Ньюкасл ГКВ 2348 селекционирован в процессе культивирования маточного штамма Н (19 пассажей) в развивающихся куриных эмбрионах при 31,5 - 32,5^oС. Это придало ему температурочувствительность и холодоадаптированность. Селекционированный штамм "Н" ГКВ 2348 вируса болезни Ньюкасл характеризуют следующими признаками: гемагглютинирующая активность 256 ГАЕ/мл, инфекционный титр 10¹¹ ЦПД/50/мл, низкое повреждающее действие в лейкоцитах человека. Изобретение позволяет снизить процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции до 25%.

Холодоадаптированный штамм "Н" вируса болезни Ньюкасл (ГКВ N 2348), используемый в качестве индуктора человеческого лейкоцитарного интерферона.