СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Российский патент 2000 года по МПК A61K38/00 A61K38/16 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к лекарственным препаратам, содержащим белковые соединения и иммуноглобулины, и может быть использовано в лечении заболеваний различной этиологии для стимуляции гуморального иммунитета и повышения неспецифической резистентности организма.

Для повышения резистентности организма, подавленной при различной патологиях и применением антибиотиков, наиболее часто применяются иммуноглобулиновые препараты (Чернуха В.К., Береговой Г.В., 1975; Павлов В.П. и др., 1988). Они эффективны при самых разнообразных патологических процессах и обладают противовирусной, антибактериальной и иммуностимулирующей активностью (Гаврилов O.K., Русанов В.М., 1982). Недостатком данных препаратов является их дороговизна, что делает эти лечебные средства в ветеринарии малодоступными для широкого круга потребителей.

Прототипом изобретения является гомологичный неспецифический иммуноглобулиновый препарат в виде 10%-ного раствора, специально произведенный для каждого вида опытных животных.

Цель данного изобретения - уменьшение расхода дорогостоящего иммуноглобулина и повышение его стимулирующего действия на гуморальный иммунитет и неспецифическую резистентность организма.

Эта цель достигается достигается тем, что готовят 1 - 2%-ный раствор иммуноглобулина в 4 - 5%-ном растворе поливинилпирролидона (молекулярная масса 12000 ± 800), доводят pH раствора до 7,4 - 7,6 и инкубируют его в течение 1 - 2 часов при температуре 20^oC.

В опытах участвовало 35 морских свинок со средним весом 0,35 ± 0,04 кг, 30 крыс со средним весом 0,145 ± 0,03 кг, 15 беспородных собак со средним весом 8,30 ± 1,00 кг и 5 собаках породы доберман-пинчер со средним весом 32,00 ± 3,30 кг.

Опытные партии иммуноглобулинов, гомологичных для каждого вида опытных животных получали осаждением сывороток этанолом модифицированным методом Кона (Холчев И.В., 1947) с помощью фракционного стола "Frigera" согласно регламенту "Иммуноглобулин человеческий нормальный" N 131-79. Концентрацию растворов иммуноглобулина до требуемых величин осуществляли ультрафильтрацией через мембрану ХМ-300 ("Amicon").

Произведенные гомологичные иммуноглобулины для каждого подопытного вида животных соответствовали необходимым стандартам.

Сравнительную оценку влияния 10%-ного иммуноглобулина и иммуноглобулинового препарата на функциональную активность и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов (in vitro) осуществлялась с помощью теста "Тест спонтанного восстановления нитросинего тетразолия" (НСТ-тест) (Методические указания, Башкирский ГМИ, 1987, 1988).

Уровень антител в крови против золотистого стафилококка, вульгарного протея, синегнойной палочки определяли в реакции пассивной гемагглютинации формалинизированных эритроцитов (РПГА) с использованием цитоплазматических растворимых антигенов (ЦПА) указанных возбудителей, полученных в лаборатории анатоксинов Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова. Титры антител логарифмировали по основанию 2 (Методические указания, Башкирский ГМИ, 1988).

При исследовании влияния изучаемых препаратов на местный воспалительный процесс, раны воспроизводили путем прижигания раскаленным докрасна специальным клеймом предварительно выбритой и продезинфицированной кожи в течение 1-1,5 с. Спустя 30 минут крысам на пораженный участок наносили 0,5 млрд. микробных клеток золотистого стафилококка.

Биометрическую обработку проводили по обычной методике (Плохинский Н.А., 1969) с применением ПЭВМ в программе "Microsoft Excel 7,0".

В таблице 1 представлены результаты сравнительной оценки влияния 10%-ного иммуноглобулина и активированного иммуноглобулинового препарата на функциональную активность и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов собак.

Через 30 минут после введения в культуру собачьих нейтрофилов 10%-ного иммуноглобулина наблюдали усиление функциональной активности нейтрофилов на 124,30 ± 2,40%, а иммуноглобулинового препарата - 183,00 ± 4,00%. Со временем функциональная активность нейтрофилов постепенно снижается и через 1,5 часа в 1 группе составила 121,10 ± 3,30% и в 2 группе - 159,00 ± 2,50%; через 5 часов данный показатель в 1 группе был равен 89,80 ± 2,50% и во 2 группе - 138,00 ± 3,10%; и, наконец, через 18 ч 4,50 ± 1,90%, 110,00 ± 2,20%, соответственно. Во всех случаях разница между показателями первой группы (10 %-ный иммуноглобулин) и второй (иммуноглобулиновый препарат).

В таблице 2 приведены результаты лейкограмм пяти здоровых собак до введения, на 5 день и на 10 день после внутримышечного введения активированного иммуноглобулинового препарата в дозе 0,15 мл на 1 кг живой массы.

По опытным группам средние показатели процентного соотношения базофилов, эозинофилов и моноцитов, как видно из таблицы 2, практически идентичны и находятся в пределах нормы.

На 5 день после инъекции препарата доля палочкоядерных нейтрофилов составила 7,60 ± 0,90%, что несколько выше нормы и достоверно больше (P = 0,95) аналогичного показателя до введения 3,00 ± 2,90%, на 10 день - 5,00 ± 0,30%. Доля сегментоядерных нейтрофилов на 5 день составила 61,60 ± 6,20%, против 56,40 ± 6,90% до введения, а на 15 день - 56,60 ± 5,60%. Процентное соотношение лимфоцитов до введения было равно 32,40 ± 6,00%, на 5 день - 23,00 ± 0,55% (что статистически достоверно меньше (P = 0,95) аналогичных показателей до введения и на 15 день после введения), на 15 день - 30,80 ± 3,00%, что в пределах нормы.

В таблице 3 приведены результаты лейкограмм пяти здоровых собак до введения, на 5 день и на 15 день после внутримышечного введения 10%-ного иммуноглобулина в дозе 0,15 мл на 1 кг живой массы. Как видно из приведенной таблицы, показатели белой крови у собак после введения данного препарата не претерпели достоверных изменений.

В таблице 4 представлены результаты исследований по влиянию 10%-ного иммуноглобулина и активированного иммуноглобулинового препарата на антигенфиксирующую способность крови собак на 15 день после внутримышечного их введения.

Log₂ титров к золотистому стафилококку после введения иммуноглобулинового препарата равен 8,00 ± 0,30, 10%-ного иммуноглобулина - 3,20 ± 0,10, контроль - 0,60 ± 0,10; к вульгарному протею - 7,60 ± 0,10, 0,70 ± 0,10, 0,30 ± 0,10, соответственно; к синегнойной палочке - 8,10 ± 0,20; 0,50 ± 0,10; 0,70 ± 0,20, соответственно.

Во всех трех тестах показатели средних Log₂ титров к микроорганизмам у собак после введения иммуноглобулинового препарата были статистически достоверно больше (P = 0,999) таковых после введения 10%-ного иммуноглобулина и контроля.

В таблице 5 показаны данные исследований влияния 10%-ного иммуноглобулина и активированного иммуноглобулинового препарата на течение местного воспалительного процесса у морских свинок.

На 9-й день после начала лечения кожных ран у животных, которым вводили 10%-ный иммуноглобулин, они зажили в среднем на 45,20 ± 2,00% к исходной площади раны, у морских свинок, которым вводили 0,9%-ный натрий хлорид - 45,30 ± 1,30%, а иммуноглобулиновый препарат - 62,90 ± 4,80% от исходной площади раны. На 12-й день после начала лечения у свинок, которым вводили 10%-ный иммуноглобулин, раны зажили в среднем на 54,70 ± 3,90% к исходной площади, у особей в контроле - 53,50 ± 3,00%, а иммуноглобулиновый препарат - 63,00 ± 2,70% от исходной площади раны. На 15-й день лечения у животных, которым вводили 10%-ный иммуноглобулин, раны зажили в среднем на 62,90 ± 4,80% к исходной площади, у морских свинок в контроле - 60,30 ± 3,80%, а иммуноглобулиновый препарат - 71,60 ± 3,60% от исходной площади раны. Во всех случаях разница между показателями заживления ран у морских свинок 3 группы и 2 группы, 3 группы и 1 группы является статистически достоверной (P = 0,9), а между 1 и 2 группами - нет.

Таким образом, при предложенном способе активации иммуноглобулиновых препаратов, последние при пониженном содержании иммунного белка обладают высокой способностью стимулировать гуморальный иммунитет и неспецифическую резистентность организма при существенном снижении стоимости курса терапии по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к лекарственным препаратам, содержащим белковые соединения и иммуноглобулины, и может быть использовано при лечении заболеваний различной этиологии для стимуляции гуморального иммунитета и повышения неспецифической резистентности организма. Иммуноглобулиновые препараты, активированные предложенным способом, обладают высокой способностью стимулировать гуморальный иммунитет и неспецифическую резистентность организма. 5 табл.

Способ повышения иммуностимулирующей активности иммуноглобулина, отличающийся тем, что готовят 1-2%-ный раствор иммуноглобулина в 4-5%-ном растворе поливинилпирролидона с молекулярным весом 120 ± 800, доводят рН раствора до 7,4 - 7,6 и инкубируют его в течение 1 - 2 ч при температуре 20^oC.