СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛАРВАЛЬНОГО ГИДАТИДОЗА (ЭХИНОКОККОЗА) ОВЕЦ Российский патент 2008 года по МПК A61D7/00 

Введение: Широкое распространение эхинококкозов, являющихся серьезной медицинской, ветеринарной и социально-экономической проблемами, обусловило масштабные потребности клинических и диагностических лабораторий в коммерческих иммуноферментных тест-системах, позволяющих проводить эффективную прижизненную серологическую диагностику ларвальных гидатидозов (эхинококкозов) у людей и сельскохозяйственных животных.

Известно, что объективность иммунологических тестов напрямую зависит от качественного состава используемых в реакции антигенов. Между тем, многокомпонентный состав антигенов гельминтов, наличие в них не только функциональных специфических, но и перекрестно-реагирующих компонентов (родо-, видо-, стадиоспецифических и др.), создают определенные трудности при разработке диагностических тест-систем. Это обуславливает необходимость проведения иммунохимических исследований по выявлению функциональных диагностически ценных антигенных компонентов и препаративного их выделения для использования в создаваемых иммунодиагностических тест-системах. Использование техники гибридом и генной инженерии позволяет создавать синтетический антиген путем подбора рекомбинантных пептидов, идентичных по функциональным свойствам диагностическим компонентам антигенов паразита.

Использование методов молекулярной биологии, в частности полимеразной цепной реакции, позволяет получать в требуемых количествах нуклеотидные последовательности, кодирующие белки паразитов, обладающие антигенными свойствами. Последующее клонирование таких фрагментов ДНК в экспрессирующих векторных системах позволяет получать in vitro стандартизованные, высокоспецифичные антигены паразитов, пригодные как для диагностических, так и для профилактических целей. Особую значимость подобные исследования приобретают при ларвальных гидатидозах, когда прижизненная паразитологическая диагностика затруднена, а объективность иммунологических тестов напрямую зависит от качественного состава используемых антигенов [4, 5, 6].

Способ выявления антител к антигенам эхинококка представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления несвязавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов барана с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащим хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам E.granulosus в анализируемом образце сыворотки.

Цель изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективного способа прижизненной диагностики эхинококоза овец на основе коммерческой иммуноферментной тест-системы «ВИГИС-эхинококк - EgF - IgG - стрип».

Техническая сущность изобретения состоит в создании технологии производства диагностически эффективной коммерческой тест-системы (ИФТС) для прижизненной диагностики эхинококоза у овец.

Наиболее близким прототипом предложенной инновации можно считать ИФТС медицинского назначения (производства ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск под названием «Эхинококк-IgG - стрип», предназначена для выявления антител к антигенам эхинококка однокамерного у человека), основанную на применении фракционированного антигена молекулярной массой 43 кДа, получаемого из цистной жидкости и протосколексов E.granulosus, причем источником паразитарного материала служат спонтанно инвазированные эхинококкозом сельскохозяйственные животные (овцы, крупный рогатый скот). На данный способ получения антигена имеется авторское свидетельство №1363564 1989 года [1].

Недостатком прототипа можно считать необходимость постоянного поиска достаточного количества нативного инвазионного материала, получаемого на мясокомбинатах их эхинококкозных цист, локализованных на внутренних органах спонтанно зараженных E.granulosus овец и крупного рогатого скота. Получаемый антиген сложно стандартизировать, так как материал для его выделения поступает неоднородный.

Известно, что в процессе эволюционного развития паразито-хозяинных отношений тканевые гельминты, в том числе и E.granulosus, приобрели способность к «антигенной мимикрии», то есть выработки паразитарных антигенов, имеющих высокую степень сходства с иммуноглобулинами хозяина для защиты от воздействия иммунной системы последнего. Именно поэтому нельзя использовать нативный антиген, полученный от инвазированных овец, для диагностики эхинококкоза у данного вида животных ввиду недостаточной специфичности теста. По-видимому, в связи с отсутствием специфичного антигена для серодиагностики у сельскохозяйственных животных до настоящего времени прижизненная диагностика ларвального эхинококкоза ИФМ разработана только для людей и применяется в медицинских лабораториях.

Коммерческих ИФТС для сельскохозяйственных животных на основе рекомбинантных антигенов эхинококка ни в России, ни за рубежом пока не производится, но они крайне необходимы при проведении эпидемической и сероэпизоотической оценки ситуации на уровне стада в очагах эхинококкоза в отдельных регионах РФ.

Данная работа отличается тем, что:

1. Исключается необходимость постоянною поиска инвазионного материала для получения нативного антигена, так как в качестве антигеного компонента для сенсибилизации твердой фазы применен стандартный антиген EgF молекулярной массой 16.7 кДа, получаемый in vitro в требуемых количествах.

2. Вышеуказанный антиген обладает высокой специфичностью и чувствительностью и поэтому может применяться для прижизненной диагностики эхинококкоза у овец.

3. В состав ИФТС введены составы реагентов и буферных растворов, что позволило снимать неспецифическое ковалентное и ионное связывание отечественного полистирола с иммуноглобулинами испытуемых сывороток крови овец, а также существенно снизило стоимость наборов за счет отказа от использования полистироловых микропанелей фирмы Costar, США.

4. Все реагенты представленной тест-системы выпускаются в жидком виде, сохраняют активность в пределах гарантийного срока использования, некоторые компоненты (например, хромогенный субстрат, ТМБ и пероксид водорода) объединены в одном растворе. Это упрощает проведение и вдвое сокращает время, затрачиваемое на иммуноферментный анализ.

Ценность изобретения состоит в том, что в качестве антигенного компонента используется стандартизованный рекомбинантный антиген молекулярной массой 16,7 кДа, обладающий достаточной чувствительностью и специфичностью в ИФР, существенно оптимизирована процедура проведения серодиагностики, вдвое сокращено время на осуществление способа прижизненной диагностики ларвального эхииококкоза овец, а желаемый технический результат можно достичь предлагаемым в данной заявке способом, состоящим из следующих этапов:

1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.

2. Технология производства компонентов ИФТС «ВИГИС-эхинококк-EgF-IgG-стрип».

3. Рекомендации по применению ИФТС «ВИГИС-эхинококк EgF-IgG-стрип», примеры конкретного исполнения.

1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.

Пробы крови отбирают в стерильные сухие пробирки в объеме не менее 1,5-2 мл от каждого животного и помещают в термостат (37°С) на 1 час. Образовавшийся сгусток крови обводят стерильной металлической спицей или стеклянной палочкой и помещают в холодильник (+4°С) на 1-2 часа для отстаивания сыворотки. Пробы сывороток отбирают в пробирки типа «Эппендорф», маркируют и сохраняют в холодильнике при +4-8°С не более 3-суток до проведения анализа. При наличии осадка эритроцитов сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут.

2. Технология производства компонентов ИФТС «ВИГИС-эхинококк-EgF-IgG-стрип».

2.1. Изготовление специфических реагентов набора: антигена, положительных и отрицательных контрольных сывороток крови овец, подготовка коммерческого антивидового конъюгата (претив IgG барана) к использованию.

2.1.1. Рекомбинантный антиген нарабатывали в репрессирующей векторной системе клетки E.coli SG-13009 - рекомбинантная плазмида pQE/EgF.

Стерильную питательную среду Лурия-Бертрани в количестве 80 мл в колбе Эрлемейера засевали клетками E.coli штамма SQ13009, содержащими рекомбинантную плазмиду pQE/EgF (в вышеуказанную плазмиду ранее был встроен фрагмент гена эхинококка размером 450 пар нуклеотидов, кодирующий синтез антигена молекулярной массой 16,7 кДа). Суспезию клеток наращивали до оптической плотности при Д600=0,5, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут и полученный осадок разбавляли фосфатно-солевым буфером в том же объеме. Вещество-индуктор изопропилтиогалактозид (IPTG) добавляли до конечном концентрации 0,3 мМ, инкубировали при 37°С в течение 2-х часов и при 43-44°С 5 минут при интенсивном перемешивании. Затем проводили центрифугирование при 5000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок замораживали при -20°С. Клетки разрушали механически или с помощью ультразвуковой установки, из клеточного лизата белки высаливали сульфатом аммония, фракции собирали в интервале от 35 до 65% насыщения. Гель-фильтрацию проводили на сефакриле S-300 на колонке диаметром 2 см и длинной 1 метр. При проведении хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе использовали колонку диаметром 2 см и длинной 20 см. Элюцию белков-антигенов осуществляли градиентом хлористого натрия в концентрации от 0 до 0,7 M. Концентрацию белка измеряли по методу Лоури, использовали спектрофотометр с длиной волны 280 нм [2, 3].

Проведенные исследования показали, что полное насыщение твердой фазы происходит при концентрации рекомбинантного антигена EgF от 7,5 до 10 мкг/мл. Дальнейшее увеличение дозы антигена к существенному повышению оптической плотности продукта ИФР не приводит.

Для получения активной твердой фазы проводили сенсибилизацию в течение 18 часов при 4°С и 1 часа при 37°С, по окончанию удаляли содержимое лунок, после чего 3-5 раз промывали их 250 мкл ФСБ-Т. Полистироловые микропанели просушивали в течение 2-3 часов при комнатной температуре, после чего запаивали в полиэтиленовые пакеты и сохраняли при 4-8°С. Установлено, что гарантийный срок хранения сенсибилизированных рекомбинантным антигеном планшетов-стрипов без снижения их активности составляет 6 месяцев в условиях бытового холодильника. При хранении в течение 12 месяцев исходная активность антигена уменьшается, что выражается в падении оптической плотности окрашенного продукта в ИФР на 10-15%.

2.1.2. Получение контрольных положительных и отрицательных сывороток крови овец.

Положительные контрольные сыворотки крови получали от спонтанно и экспериментально зараженных овец. Динамику титров специфических антител определяли ИФМ, сыворотки отбирали по п.1, для увеличения срока хранения в них добавляли консервант (мертиолят натрия до 0,05% по объему), при этом титр специфических антител в ИФА поддерживался на уровне не менее 1:800.

Отрицательные контрольные сыворотки получали от клинически здоровых овец, проверяли в ИФА, далее по п.1., 2.1.2. При отработке параметров ИФА отрицательную сыворотку исследовали в тех же разведениях, что и положительную для сопоставления показателей оптической плотности, причем все сыворотки начинали титровать с разведения 1:100.

2.1.3. Антивидовой конъюгат против иммуноглобулинов класса G барана приобретали в ГУ НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Для титрования антивидового коньюгата готовили двукратные разведения на ФСБ, начиная от 1:100 и до 1:25600, ИФА осуществляли по стандартной схеме. По изменению окраски проводили визуальный учет реакции, принимая за титр конъюгата то его наибольшее разведение, дающее темно-желтое окрашивание в лунках. Обычно рабочий титр антивидового конъюгата составлял 1:8000.

2.2. Приготовление неспецифических реагентов набора: фосфатно-солевого буфера, разводящих буферных растворов для сывороток и конъюгата, субстратного раствора на основе ТМБ, стоп-реагента.

2.2.1. Фосфатно-солевой буферный раствор (0,01М ФСБ-Т, рН 7,4) используется для приготовления отмывающей жидкости, а также как компонент разводящих растворов для сывороток и конъюгата. Состоит из калия фосфорнокислого однозамещенного (0,01М), хлористого калия (0,01М), калия фосфорнокислого двухзамещенного (0,15М), хлористого натрия (0,18М) и твин-20 (0,5%).

2.2.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБРС) представляет собой ФСБ, в котором увеличено содержание хлористого натрия до 0,36М и добавлены БСА (бычий сывороточный альбумин-0,5%), твин-20 (до 1%) и мертиолят натрия (0,05%).

2.2.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) имеет тот же состав, что и РБРС (п.2.2.2), но количество БСА увеличено до 1,5% и твин-20 до 1,5%. Повышенное содержание хлористого натрия, инертного белка (альбумина) и твин-20 блокирует неспецифическое связывание полистирола твердой фазы российского производства с антителами испытуемых сывороток.

2.2.4. Однокомпонентный готовый к использованию субстратный раствор на основе ТМБ (ТУ 9398-01/в-11361534-2004) представляет собой стабилизирующий буфер, содержащий 3,3'5,5'-тетраметилбензидин и пероксид водорода.

2.2.5. Останавливающий ферментативную реакцию раствор (стоп-реагент) - 0,5М серная кислота вносится в количестве 100 мкл в лунку. После добавления стоп-реагента в течение 15 минут проводили учет результатов реакции.

В процессе реакции, катализируемой пероксидазой, происходит окисление ТМБ пероксидом водорода в продукт, имеющий синюю окраску, которая переходит в желтую при остановке ферментативной реакции добавлением стоп-реагента.

Результаты ИФА оценивали визуально или на спектрофотометре 340/АТС фирмы STL-Labsistems (Австрия) с автоматическим ридером и вертикальным лучом света при длине волны 450 нм (ОП 450).

Источники информации

1. Клименко В.В., Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В. Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа, АС № 1363564, 1989 г.

2. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И.// Тр. Всерос. Ин-та гельминтол. - 2004. - Т.40. - С.256-274.

3. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Асеев В.В., Руденская Ю.А. //Матер. Международной научно-практ. конф. "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов". - М. - 2005. - С.279-284.

4. Lightowlers M.W., Jensen O.E., Fernandez J.A., Iriarte D.J., Woollard D.J., Jenkins D.J., Heath D.D.//Int. J. Parasitol. - 1999. - V.29. - P.531-534.

5. Smith D.B., Johnson R.S.//Gene. - 1988. - N67. - P. - 1513-1522.

6. Woollard D.J., Heaht D.D., Lightowlers M.W. // Parasitology - 2000. - V.121. - №2. - P.145-153.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике антропозоонозов, и может быть использовано для диагностики ларвального эхиноккокоза овец. Способ основан на выявлении специфических антител в сыворотке крови зараженных овец методом непрямого твердофазного ИФА, включает использование рекомбинантного антигена EgF молекулярной массой 16,7 кДа и солевых буферных растворов определенного состава. Антиген получают в экспрессионной векторной системе: клетки Escherichia coli SG13009-векторная плазмида pQE-co встроенным геном Echinococcus granulosis EgF. В качестве хромогенного субстрата используют 3,3' 5,5' тетраметилбензидин с 0,2% пероксидом водорода. Реакцию останавливают добавлением 0,5 М серной кислоты. Полученный результат оценивают по степени окрашивания реакционной смеси в лунках. Изобретение позволяет проводить прижизненную диагностику ларвального эхиноккокоза овец в короткие сроки при минимуме затрат.

Способ прижизненной диагностики ларвального эхиноккокоза овец основан на выявлении специфических антител в сыворотке крови зараженных овец методом непрямого твердофазного ИФА, включающий использование рекомбинантного антигена EgF молекулярной массой 16,7 кДа, получаемого в экспрессионной векторной системе: клетки Escherichia coli SG13009-векторная плазмида pQE-co встроенным геном Echinococcus granulosis EgF в концентрации 7,5-10 мкм/мл и солевых буферных растворов, содержащих 0,15 М калия фосфорнокислого двухзамещенного, 0,01 М калия фосфорнокислого однозамещенного, хлористого натрия 0,3 М, 0,5% альбумина и 1,5% альбумина для коньюгата, 1% твин-20 для нанесения сывороток и 1,5% при использовании коньюгата; в качестве хромогенного субстрата используется 3,3' 5,5' тетраметилбензидин с 0,2%-ным пероксидом водорода, для остановки реакции используется 0,5 М серная кислота, а полученный результат оценивается по степени окрашивания реакционной смеси в лунках.