СПОСОБ СЕМЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ EUSTOMA RUSSELIANUM Российский патент 2000 года по МПК A01H4/00 A01G9/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к сохранению, воспроизводству генофонда и получению в культуре ткани оздоровленного посадочного материала.

Известен способ семенного размножения эустомы. По этому способу используют вызревшие свежесобранные или длительно хранившиеся семена. В качестве субстрата при семенном размножении применяют торф, песок, перлит и дерновую почву в различных соотношениях. После тщательного перемешивания компонентов и увлажнения субстрата его оставляют на 5 дней для дозревания, а затем набивают ящики с сетчатым дном, предотвращающим переувлажнение. После уплотнения субстрата на его поверхности делают линейные бороздки глубиной 3-4 см на расстоянии 8-10 см друг от друга, в которые высевают семена. Для повышения равномерности высева мелких семян эустомы (масса 1000 шт. семян составляет около 0,04 г) их перемешивают с просеянным мелким песком. В оптимальных условиях семена быстро прорастают. После достижения всходами двух настоящих листочков растения можно пересаживать на постоянное место [1]. Несмотря на широкое распространение этого способа размножения эустомы, он имеет ряд недостатков. Время получения взрослых продуктивных растений весьма продолжительно и составляет 6-8 месяцев. Семена в процессе хранения быстро теряют всхожесть (до 75% за 2 года). При проращивании семян в субстратах обязательным является поддержание оптимальных условий: влажность субстрата 70%, температура +24...26^oC, освещенность 3-4,5 тыс. лк. Нарушение этих требований, особенно температуры, может привести к резкому снижению выхода готовой продукции.

Известен также способ размножения растений in vitro, по которому для культуры ткани используют питательную среду Мурасиге и Скуга [2] (см. табл. A).

Применение этого способа выращивания растений in vitro в замкнутом цикле выращивания с привлечением методов биотехнологии способствует увеличению коэффициента размножения при одновременном освобождении их от грибной, бактериальной инфекции и создает возможность для хранения генофонда в стерильных условиях.

Однако способ имеет некоторые недостатки, заключающиеся в том, что его схема включает различные режимы стерилизации в зависимости от применяемого при обработке стерилизующего вещества, а используемая основа прописи питательной среды имеет различные модификации. В зависимости от целей, используемой ткани, с учетом биологических особенностей культуры, для каждого конкретного объекта требуется разработка всех режимов in vitro, о чем свидетельствует рекомендуемый авторами широкий диапазон концентраций ИУК и кинетина. Кроме того, отдельные культуры обладают высокой требовательностью к концентрациям минеральных солей.

Целью изобретения является увеличение коэффициента размножения семенного потомства in vitro и получение выравненного оздоровленного посадочного материала.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения оздоровленного посадочного материала Lisianthus russelianus, включающем подготовку семян, посев их на субстрат и культивирование до получения растеньиц, согласно изобретению при обработке семена намачивают 10 минут в 2% растворе гипохлорита кальция с последующей четырехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой с интервалом 5-10 минут и высевают в условиях in vitro на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и 0,5 мг/л ИУК при pH среды 5,8. Сопоставительный анализ заявленного технического решения с прототипом показывает, что предложенный способ получения оздоровленного посадочного материала эустомы отличается намачиванием семян в течение 10 минут в 2% растворе гипохлорита кальция и последующим четырехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой с интервалом 5-10 минут и посевом в условиях in vitro на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и 0,5 мг/л ИУК при pH среды 5,8. Признаки, отличающие заявленное техническое решение от прототипа, не выявлены нами при излучении данной и смежных областей, что обеспечивает заявленному способу семенного размножения in vitro посадочного материала эустомы соответствие критерию "изобретательский уровень".

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Все подготовительные операции, связанные с культурой ткани эустомы, проводят в рабочей комнате, оборудованной стеллажами, сушильным шкафом, автоклавами и аппаратом для изготовления ватно-марлевых пробок. Для изготовления ватно-марлевых пробок используют аппарат марки У4.2, основным рабочим органом которого является вращающаяся игла. При подаче ваты на иглу образуется пробка, поверхность которой уплотняется оправкой. В аппарате предусмотрена регулировка для изменения высоты пробки. Съем пробки с вращающейся иглы производится автоматически. Пробку обтягивают двумя слоями марли и голову завязывают ниткой. Для мытья пробирок и посуды применяют хромпик, а также синтетические моющие средства с последующей промывкой сначала горячей водопроводной водой, а затем дистиллированной водой. В дальнейшем проводят их сушку и стерилизацию. Сухой горячевоздушной стерилизации при +160...+170^oC в течение одного часа подвергают инструменты, пробирки, пробки и посуду. По мере охлаждения в пробирки вставляют ватно-марлевые пробки. Для удобства пробирки по 10-20 шт. упаковывают в крафт- бумагу, связывают веревкой и автоклавируют при 1,5 атм. в течение одного часа. Стерильные пробирки, инструменты и посуду переносят в ламинарную комнату. Питательная среда для тканевой культуры включает большой набор компонентов как минерального, так и органического происхождения, растворы которых готовят на бидистиллированной воде. Для удобства в работе заранее готовят маточные растворы солей, отдельно макро- и микроэлементов из расчета на 10 л среды или каждой соли отдельно, используя для этого мерные колбы емкостью 100 мл с притертыми пробками. Хранятся растворы в холодильнике при температуре +2...+3^oC. Для приготовления среды отбирают пипеткой по 10 мл каждого солевого раствора. В день приготовления среды взвешивают (готовят) только соли железа, а также сахарозу, агар, витамины и ИУК. Навески компонентов и порции маточных растворов переносят в литровую коническую колбу с бидистиллированной водой при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Расчетный объем среды не должен превышать 750 мл. Затем устанавливают требуемую величину pH среды, для чего используют 0,1 н. растворы КОН и HCl. B оставшемся объеме бидистиллированной воды (около 200 мл) растворяют агар при нагревании на водяной бане. Растворы сливают и тщательно перемешивают (объем среды доводят до 1 л). Готовую среду разливают в простерилизованные пробирки и автоклавируют при 0,75 атм. в течение 20 минут. Срок хранения стерильной среды - не более 5 дней.

Для поверхностной стерилизации семян эустомы было испытано большое количество стерилизующих агентов. Для лучшей прилипаемости стерилизующего агента к поверхности семян в приготовленные растворы (по 200 мл) добавляют по 2 капли детергента Твин-20. В перемешиваемые на магнитной мешалке растворы переносят расчетные количества семян. По мере истечения экспозиции намачивания все сосуды со стерилизуемыми семенами закрывают перевернутыми стерильными чашками Петри и переносят в ламинар-бокс, где растворы сливают с семян. Семена 4 раза промывают стерильной дистиллированной водой с интервалами 5-10 минут и переносят в стерильную чашку Петри. Стерильным инструментом семена по 1-3 шт. высевают в пробирки на поверхность стерильной агаризованной питательной среды. Пробирки плотно закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и переносят в климатическую камеру с регулируемой интенсивностью освещения и температурой. Наибольший выход жизнеспособных сеянцев in vitro обеспечивает 2%-ный раствор гипохлорита кальция с 10-минутной экспозицией намачивания (табл. 1).

Для органогенеза семян эустомы in vitro было испытано 14 различных составов (модификаций) питательных сред. Во всех случаях наибольший выход (65%) жизнеспособных микрорастений наблюдали на питательной среде Мурасиге и Скуга [2], содержащей минеральную основу, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агара (pH 5,8).

На 30 сутки рост образовавшихся корней сеянцев in vitro останавливается. В ряде случаев у основания побегов образуется плотный, светло-зеленой окраски каллус. Позже на этих сеянцах у основания побега наблюдается образование и рост 1-4 миниатюрных побегов, которые в процессе микроклонирования на свежеприготовленной питательной среде того же состава давали типичные растения эустомы. Отмеченный факт многократного побегообразования из одного семени in vitro наблюдали на сортах Ametist blue и Ametist pink. Всхожесть семян со сроком хранения 2 года составляет 80% (учет проводился на стадии первой пары листьев), из них заражение наблюдали в 10% случаев.

Контрoльный высев семян в субстрат при поддержании необходимых параметров выращивания показал всхожесть около 25%. Во всех случаях in vivo из одного семени было получено одно растение.

Для доращивания микрорастения (одно семя - растеньице) пересаживали на свежеприготовленную среду того же состава. На 20-24-е сутки после пассажа формируются растения с двумя-тремя междоузлиями, пригодные для адаптации in vivo. Вегетация на пробирочной фазе развития проходила в климатической камере при +20...+24^oC и 16- часовом фотопериоде с интенсивностью освещения около 4500 лк.

В связи с тем, что отдельные культуры проявляют различную реакцию на концентрацию солей в питательной среде, были заложены опыты для выяснения характера подобной реакции у эустомы. С этой целью полученные растеньица пассировали на двух типах питательных сред: Мурасиге и Скуга [2] и Уайта [3] . Каждая среда применялась в четырех модификациях: жидкая либо агаризованная, с полной либо с половинной концентрацией неорганических веществ. Оптимальной оказалась агаризованная питательная среда Мурасиге и Скуга [2] с половинным содержанием макро- и микроэлементов, 6 г/л агара и 20 г/л сахарозы.

Для увеличения выхода in vitro растеньиц с хорошей корневой системой были испытаны три состава питательных сред (табл. 2).

Приведенные данные показывают, что питательная среда с половинным содержанием макро- и микроэлементов [2], 6 г/л агара, 20 г/л сахарозы и 0,5 мг/л ИУК обеспечивает выход миниатюрных растеньиц до 93%.

Семенное размножение in vitro предложенным способом сортов Ametist blue и Ametist pink в течение двух лет показало, что этот способ является промышленно применимым и позволяет воспроизводить, сохранять и получать в результате размножения однородные растения (микроклоны) с высокой жизнеспособностью при одновременном сокращении материально-трудовых затрат и производственных площадей. Отмеченный факт многократного побегообразования из семени в культуре ткани может быть использован в ускорении селекционного процесса, для выведения сортов с устойчивостью к концентрациям солей, температурным факторам и особенно в организации F₁- посевного материала.

Источники информации
1. Смирнова З. Лизиантус - перспективная промышленная культура. Цветоводство, 1991, N 5, С.9. - Прототип.

2. Murashige T., Scoog F. - Physiol. plant., 1962. Vol. 15. P.473-497.

3. Биотехнология растений: Культура клеток. М.: Агропромиздат, 1989, - 280 с.

Использование: сельское хозяйство. Сущность изобретения: размножение эустомы заключается в обработке семян путем замачивания на 10 мин в 2%-ном растворе гипохлорита кальция с последующей четырехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой с интервалами 5-10 мин, после чего их высевают в условия in vitro на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и 0,5 мг/л ИУК при рН среды 5,8 и культивируют на этой среде до получения растеньиц, готовых к пересадке в грунт. 3 табл.

Способ семенного размножения Eustoma russelianum in vitro, включающий подготовку семян, посев их на субстрат и культивирование до получения растеньиц, отличающийся тем, что при подготовке семена намачивают 10 мин в 2%-ном растворе гипохлорита кальция с последующей четырехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой с интервалами 5 - 10 мин и высевают в условиях in vitro на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара, 0,5 мг/л ИУК, при pH среды 5,8.