СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЗДОРОВЛЕННОГО IN VITRO ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА GERBERA JAMESONII BOLUS Российский патент 2000 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам получения оздоровленного посадочного материала в культуре ткани, сохранению и воспроизводству генофонда цветочных культур.

Известен способ семенного размножения герберы. Для получения полноценных семян растения следует опылять искусственно. Пыльцу для опыления собирают со зрелых соцветий через 3-4 дня после их распускания, подсушивают и помещают в небольшой стакан. В сухом помещении пыльца хранится 50-70 дней. Цветки опыляют мягкой кисточкой, нанесением на рыльце пестика легким прикосновением. Созревают семена летом через 18-20 дней после опыления, весной и осенью через 30-35 дней; на одном соцветии созревают до 100 семян. Их собирают, подсушивают при +24....35^o и очищают от летучек. В таком состоянии их можно хранить 4-5 месяцев; при необходимости более длительного хранения (до 1 года) семена помещают в эксикатор с безводным хлоридом кальция и хранят при +5^o. В качестве субстрата для посева семян используют смесь торфа и перлита, торфа и песка, среднезернистый песок, дерновую землю и т.д. Ими набивают небольшие ящики и слегка уплотняют. Сеют семена в субстрат по схеме 2х2х3 см. Ящики с семенами переносят в культивационное помещение с температурой +21. ..24^o, влажностью субстрата 70% и прикрывают бумагой или марлей. Первые всходы появляются через 4-6 дней, а массовые - через 10-15 дней. На 30-40 сутки после посева семян проводят пикировку сеянцев в ящики, горшки, стаканчики различных размеров. В качестве субстрата используют те же компоненты, что и при посеве семян. Спустя 6-8 недель после пикировки растения бывают готовы для высадки на постоянное место [1]. Существенным недостатком данного способа размножения является высокая гетерозиготность семенного потомства, низкая продуктивность и декоративность цветов.

Известен и способ вегетативного размножения герберы - деленками. По этому способу отбирают относительно здоровые, высокопродуктивные растения. Их освобождают от субстрата, тщательно отмывают, надземную массу удаляют. Поверхность куста обрабатывают одним из поверхностно стерилизующих агентов для предотвращения развития грибных заболеваний. Куст герберы делится отточенным ножом (скальпелем), который после деления каждого куста дезинфицируется. В каждой части деленки оставляют укороченный росточек, состоящий из 3-5 листочков и минимального количества корней. 50% листьев на деленке удаляют для уменьшения транспирации в процессе укоренения. Деленки тщательно дезинфицируют и намачивают в растворе ауксина для усиления ризогенеза. Одно двулетнее растение делится на 2-6 деленок, трехлетка - на 8-12 деленок, которые высаживают в субстрат на укоренение. Разработаны температурные режимы воздуха и субстрата, относительной влажности воздуха и субстрата, приемы агротехники, поверхностной стерилизации деленок и субстратов, стимуляции ризогенеза и т.д. От одного растения в годичном цикле размножения можно получить 50-100 саженцев. Получаемый посадочный материал при размножении герберы деленками является генетически однородным [2]. Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения, возможность передачи с посадочным материалом грибных, бактериальных, вирусных и микоплазменных заболеваний.

Известен также способ размножения герберы in vitro [3], включающий следующие этапы:
1 стерилизацию исходных деленок с последующим их введением в культуру in vitro;
II получение каллусной культуры с последующей регенерацией эксплантов;
III цитологический анализ эксплантов для установления генетической однородности материала с включением этапа их накопления;
IV микроразмножение in vitro.

Разработанный способ микроразмножения, по мнению авторов, может обеспечить получение до миллиона саженцев от одного маточного растения при годичном цикле выращивания, позволяет освобождать растения от грибной, бактериальной и вирусной инфекции, создает благоприятную возможность для хранения генофонда в стерильных условиях. Данный способ размножения герберы выбран нами в качестве прототипа (см. таблицу А в конце текста). Однако прототип имеет недостатки, заключающиеся в том, что разработанная схема микроразмножения герберы является сложной, ступенчатой, питательные среды включают высокие концентрации агара, сахарозы, кинетина и сульфата аденина.

Целью изобретения является упрощение схемы микроразмножения, минимизация питательных сред при размножении герберы in vitro.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения оздоровленного посадочного материала Gerbera jamesonii Bolus, включающем стерилизацию исходных деленок, эксплантирование, субкультивирование и индукцию ризогенеза in vitro побегов на питательных средах, согласно изобретению деленки намачивают 30 мин в 0,5% растворе бенлата с последующей обработкой в течение 15 мин в 10% растворе хлорамина Б, а затем четырежды промывают стерильной дистиллированной водой с интервалом 10 - 12 мин. Субкультивирование черенков и индукцию ризогенеза проводят на модифицированной питательной среде Мурасиге и др. [3], включающей 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л аденина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, а чередование циклов микроразмножения на среде с содержанием 5 мг/л кинетина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара и на среде с содержанием 1 мг/л БАП, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара при pH 5,6-5,8. Сопоставительный анализ заявленного технического решения с прототипом показывает, что предложенный способ микроразмножения герберы отличается упрощенной схемой введения в культуру деленок, режимом стерилизации, составами питательных сред в процессах эксплантирования, субкультивирования с чередованием циклов размножения и питательной средой для ризогенеза in vitro побегов, включающий 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNaЭДТА), дополненной 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара при pH, равном 5,6-5,8.

Признаки, отличающие заявленное техническое решение от прототипа, не выявлены нами при изучении данной и смежных областей, что обеспечивает заявленному способу микроразмножения герберы соответствие критерию "изобретательский уровень".

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Все подготовительные операции, связанные с культурой ткани герберы, проводят в рабочей комнате, оборудованной стеллажами, сушильным шкафом, автоклавами, дистиллятором и аппаратом У4.2 для изготовления ватно-марлевых пробок. Подготовительные операции состоят из подготовки необходимой посуды, инструментов, приготовления маточных и рабочих растворов макро- и микроэлементов, витаминов и регуляторов роста. Пробирки и другую посуду освобождают от упаковки, складывают в емкость, кипятят, стенки отмывают ершом с моющими средствами, затем промывают под проточной водой, ополаскивают дистиллированной водой. В дальнейшем проводят их сушку и стерилизацию. Сухой горячевоздушной стерилизации при +160... 170^o в течение одного часа подвергают инструменты, пробирки и посуду. По мере охлаждения в пробирки вставляют ватно-марлевые пробки. Для удобства пробирки по 10-20 шт упаковывают в крафт-бумагу, связывают веревкой и автоклавируют при 1,5 атм в течение 1 часа. Стерильные пробирки, инструменты и посуду переносят в операционную комнату. Питательная среда для тканевой культуры включает большой набор минеральных и органических компонентов, которые растворяют в бидистиллированной воде. Для удобства в работе заранее готовят маточные растворы солей отдельно макро- и микроэлементов из расчета на 10 л среды, используя для этого мерные колбы емкостью 100, 500 и 1000 мл с притертыми пробками. Хранятся растворы в холодильнике при температуре +2...3^o. Для приготовления рабочего раствора питательной среды отбирают пипеткой по 5-10 мл каждого солевого раствора. В день приготовления среды готовят только соли железа, а также сахарозы, агара, витаминов, регуляторов роста. Навески компонентов и порции маточных растворов переносят в литровую коническую колбу при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Расчетный объем среды не должен превышать 750 мл. Затем устанавливают требуемую величину pH среды, для чего используют 0,1 н. растворов КОН и HCl. В оставшемся объеме бидистиллированной воды (около 200 мл) растворяют агар при нагревании на водяной бане. Растворы сливают, перемешивая и доводя бидистиллированной водой до 1 л. Готовую среду разливают в простерилизованные пробирки и автоклавируют в течение 20 мин при 0,7-0,9 атм. Срок хранения стерильной среды -не более 5 дней.

Исходные экспланты для культуры in vitro изолируют из чистосортных маточных растений, которые выращивают так, чтобы точка роста была выше уровня субстрата. При такой посадке розетки листьев образуются на стеблевых частях растения и позволяет получить стерильную культуру побегов с наибольшим выходом. Скальпелем отрезают от растения черенок, обрывают наружные листья, а оставшуюся вегетативную почку размером 1,0-3,0 см, состоящую из верхушки побега и 3-5 листовых черешков и субапикальной части стебля (меристема), аккуратно протирают ватой, смоченной в 70% этаноле. Почки помещают в марлевые мешочки и затягивают веревкой. В этом мешочке проводит все операции, связанные с поверхностной стерилизацией и последующей их промывкой в условиях стерильного бокса.

Для лучшей прилипаемости стерилизующего вещества к поверхности изолированной ткани герберы в приготовленные растворы (по 200 мл) добавляют 2-3 капли детергента Твин-20. Приготовленные мешочки с почками погружают на 30 мин в 0,5% раствор бенлата, затем переносят их на 15 мин в 10% раствор хлорамина Б и четырежды промывают с интервалом 10-12 мин стерильной дистиллированной водой.

Сосуды со стерилизованным материалом прикрывают перевернутыми стерильными чашками Петри. В асептических условиях пинцетом и скальпелем удаляют листовые черешки, прикрывающие апекс. Отрезают верхушку побега размером 1-2 мм и стерильной иглой переносят в пробирку на поверхность агаризованной питательной среды 1 (табл. 1). Приведенный метод стерилизации почек обеспечивает наибольший выход стерильного материала на стадии эксплантирования, хотя 60% высаженных эксплантов погибает от инфекции и действия концентраций стерилизующих веществ. Культивирование эксплантов проводят на питательной среде 1, дополненной 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л адениниа, 40 г/л сахарозы и 8 г/л агара. Сравнительная оценка результатов экспериментальных исследований показала достаточно высокую эффективность влияния приведенных компонентов в процессах микроразмножения сортов герберы (табл. 2). Пробирки с высаженными апексами переносят в вегетационную камеру при +25^o, 16-часовом фотопериоде, относительной влажности 70% и интенсивности освещения 5000 лк.

На 28-30 сутки формируются вегетативные побеги герберы. В ряде случаев после первых двух недель культивирования наблюдается незначительное инфицирование некоторых эксплантов. В этом случае проводят повторную стерилизацию. Для этого в ламинар-боксе достают из сосуда зараженный эксплант, отрезают инфицированную часть и погружают на 2-3 мин в 5% раствор хлорамина Б, ополаскивают в стерильной воде и высаживают на свежую питательную среду того же состава.

Метод микроразмножения основан на двух явлениях: а) возникновении почек из существующих тканей меристем; б) образование меристематических очагов и дифференциация стеблевых почек. Меристематическое происхождение in vitro таким способом гарантирует им генетическую однородность. Для увеличения коэффициента размножения образовавшиеся экспланты пересаживают на питательную среду 2 (табл. 1). Введение в питательную среду 5 мг/л БАП индуцировало максимальное пробуждение и развитие пазушных почек герберы. От одной меристематической верхушки за один пассаж в ряде случаев получено до 30 побегов (табл. 3). Однако при длительном пассировании этих побегов на средах с той же концентрацией БАП новообразующиеся побеги имели морфологические изменения, плохо укоренялись, погибали, что, вероятно, было связано с накоплением фитогормона в тканях больше необходимого уровня. Отмеченное явление позволило сделать вывод о необходимости чередования циклов культивирования на средах с различными цитокининами при одновременном обеспечении достаточной скорости микроразмножения in vitro.

Проведенные экспериментальные исследования по микроразмножению позволили разработать среды с оптимальным уровнем цитокининов (2а и 2б, табл. 1 и 4). Введение в питательную среду 2а 5 мг/л кинетина, а в среду 2б 1 мг/л БАП в комплексе с приведенными в таблице 1 компонентами питательных сред с учетом параметров вегетации в фитотронированной камере, позволили избежать токсического действия цитокининов и получить полноценные микрочеренки. Цикл микроразмножения (активация новообразования пазушных почек и микроклонирование развивающихся побегов) повторяли 12-15 раз в течение 2 лет (табл. 4). При более длительном культивировании скорость размножения уменьшалась, появлялись неактивные почки, усиливался каллусогенез.

Сформированные побеги переносят на среду 3 для ризогенеза (табл. 1). Питательная среда включает 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNaЭДТА) по прописи (3), с добавлением 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара при pH 5,6-5,8. На 20-24 сутки побеги герберы образуют корни и достигают стандартных размеров. Полученные растения-регенераты герберы легко адаптируются в условиях in vivo. В зависимости от преследуемых целей (размножение селекционного, коллекционного материала, сохранение in vitro генофонда) используется технологическая последовательность поэтапного прохождения экспланта на различных составах питательных сред:
а дня длительного массового размножения - следующая технологическая последовательность:

Предлагаемый способ размножения посадочного материала Gerbera jamesonii Bolus (клон, гибрид, сорт и мериклон) является промышленно применимым и позволяет воспроизводить, сохранять и получать генетически однородные высококачественные жизнеспособные растения при одновременном упрощении схемы прохождения технологических этапов (из схемы исключены этапы получения каллусной культуры и цитологический анализ эксплантов для установления генетической однородности получаемого посадочного материала). Применение разработанных прописей питательных сред в комплексе с параметрами in vivo способствует сокращению материально-трудовых затрат и производственных площадей.

Источники информации
1. Reinhard B., Werner D., Wolfgang F., et al. Gerbera. Neuman Verlag. 1969, 180 s.

2. Звигздыня В. А. , Гутмане Л.Я., Муценице Г.Я. Гербера в Латвии. Зинатне, 1984, 140 с.

3. Murashige T. , Serpa M., Jones B. Clonal Multiplication of Gerbera through Tissue Culture. HortScience, v.9(3), 1974, pp.175-180.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства и биотехнологии при получении оздоровленного посадочного материала в культуре ткани. Способ включает стерилизацию деленок, эксплантирование, пассирование микрочеренков и ризогенез побегов in vitro. При подготовке деленки стерилизуют ступенчато, вначале 30 мин в 0,5%-ном растворе бенлата, затем 15 мин в 10%-ном растворе хлорамина Б и четырехкратно промывают в дистиллированной воде с интервалом в 10-12 мин. Посадку и культивирование эксплантов осуществляют на среде с 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л аденина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, пассирование микрочеренков с чередованием циклов культивирования проводят на среде с содержанием 5 мг/л кинетина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара и на среде с содержанием 1 мг/л БАП, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, а ризогенез in vitro - на 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNaЭДTA), дополненной 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара и pH 5,6 - 5,8. Изобретение позволяет упростить схему микроразмножения, сократить материально-трудовые затраты и производственные площади. 5 табл.

Способ получения оздоровленного in vitro посадочного материала Gerbera jamesonii Bolus, включающий стерилизацию деленок, эксплантирование, пассирование микрочеренков, ризогенез побегов, отличающийся тем, что деленки стерилизуют 30 мин в 0,5%-ном растворе бенлата, затем 15 мин в 10%-ном растворе хлорамина Б и четырехкратно промывают стерильной дистиллированной водой с интервалом в 10 - 12 мин, а индукцию органогенеза и субкультивирование эксплантов проводят на питательной среде Мурасиге и др., дополненной 5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 10 мг/л ИУК, 10 мг/л аденина, 40 г/л сахарозы и 8 г/л агара, причем циклы культивирования чередуют при содержании 5 мг/л кинетина, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара и при содержании 1 мг/л бензиламинопурина (БАП), 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, при этом ризогенез побегов in vitro проводят при 50% концентрации минеральных солей (кроме FeNa ЭДТА), дополненной 1 мг/л ИУК, 25 г/л сахарозы, 7 г/л агара при pH 5,6 - 5,8.