Способ клонального микроразмножения кардамона черного (Amomum tsao-ko) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и лекарственных растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала кардамона черного (Amomum tsao-ko Crevost & Lemarié), трудноразмножаемого генеративным и вегетативным способами. Полученные растения могут быть использованы для реинтродукции кардамона черного в естественные места произрастания, в качестве ценного ресурса для медицинской и пищевой промышленности.

Лекарственные растения используют в здравоохранении с незапамятных времен. Во всем мире постоянно проводят исследования по проверке их эффективности, на основании которых созданы лекарственные препарата на растительной основе. Стоимость мирового рынка лекарственных растительных продуктов превышает 100 миллиардов долларов США в год. По данным Всемирной организации здравоохранения, примерно 80% населения земного шара зависит от традиционных систем здравоохранения в сочетании с натуральными продуктами.

В современном мире наметилась острая необходимость в поиске новых лекарственных препаратов, действие которых направлено на борьбу с трудно излечимыми болезнями. Перспективным направлением в этой области является изучение редких и эндемичных растений, используемых в народной медицине, природные ресурсы которых находятся на грани исчезновения.

В настоящее время большой интерес представляют растения рода Amomum Roxb. (Семейство Zingiberaceae Lindl.), насчитывающий от 150 до 188 видов растений [Lamxay, V.A revision of Amomum (Zingiberaceae) in Cambodia, Laos and Vietnam / V. Lamxay, M. Newman // Edinburgh Journal of Botany. - 2012. - Vol. 69(1). - P. 99 - 206], из которых 21 вид зарегистрирован во Вьетнаме [Nguyen, Q.B. Flora of Vietnam / N.Q. Binh. - Hanoi: Publishing House of Natural Science and Technology, - 2017. - Vol. 21. - P. 127 - 169]. Особого внимания заслуживают черный кардамон (Amomum tsao-ko Crevost & Lemarié) - входящий в состав 188 видов Amomum. Растения сегодня широко распространены в Китае, Лаосе и Вьетнаме [Lamxay, V. A revision of Amomum (Zingiberaceae) in Cambodia, Laos and Vietnam / V. Lamxay, M. Newman // Edinburgh Journal of Botany. - 2012. - Vol. 69(1). - P. 99 - 206]. Например, во Вьетнаме A. tsao-ko, это растение известно как «Кардамон», или «Do-ho» и широко распространено в провинциях Ха Джианг, Лао Кай, и Лай Чау [Nguyen, Q.B. Flora of Vietnam / N.Q. Binh. - Hanoi: Publishing House of Natural Science and Technology, - 2017. - Vol. 21. - P. 127 - 169]. A. tsao-ko входит в класс однодольных и является многолетним травянистым растением. A. tsao-ko является ценным недревесным продуктом леса, а также важным лекарственными растением с прекрасным экспортным потенциалом. В традиционной медицине семена черного кардамона используют как лекарство при респираторных заболеваниях, миалгии, неврозах, ревматизме и каменной болезни в почках, а также применяют от болей и вздутия в животе, икоты, рвоты, диареи, малярии, кариесе и др. [Verma, S.K. Greater cardamom (Amomum subulatum Ro xb.) - A cardio-adaptogen against physical stress / S.K. Verma, V. Rajeevan, A. Bordia et al. // Journal of Herbal Medicine and Toxicology. - 2010. - Vol. 4(2). - P. 55-58]. Кроме того, эфирное масло обладает противомикробным и противогрибковым действием, а экстракт сухофруктов A. tsao-ko оказывает ингибирующее действие на рост клеток рака шейки матки Hela, опухолевых клеток печени HepG-2 и SMMC-7721 и клеток рака легкого А549 [Zhu, Y. Characterizations of glucose-rich polysaccharides from Amomum longiligulare T.L. Wu. fruits and their effects on immunogenicities of infectious bursal disease virus VP2 protein / Y. Zhu, X. Wang, C. Zhang et al. // International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. - Vol. 183. - P. 1574-1584].

Основной способ размножения черного кардамона - семенной и вегетативный (корневищами) [Lim, Т.K. In edible medicinal and non-medicinal plants / Т.K. Lim. - Dordrecht, Netherlands: Springer Publ., - 2013. - Vol. 5. - P. 801]. Однако эти способы имеют как преимущества, так и недостатки. Например, при размножении семенами, взрослые растения дают более высокий и качественный урожай, но из-за твердой оболочки всхожесть семян очень низкая. Это приводит к получению ограниченного количества посадочного материала. При использовании корневищ, возникает вероятность получения посадочного материала восприимчивого к заболеваниям, вызываемым вирусами, грибами или бактериями, что способствует снижению урожая и получению плодов низкого качества. Таким образом, классические методы размножения имеют ограничения и не всегда отвечают потребностям производства. Развитие методов клеточной биотехнологии позволяет решить данную проблему путем получения высококачественного посадочного материала in vitro, с применением метода клонального микроразмножения.

В мире проводят исследования по размножению in vitro некоторых видов рода Amomum, таких как A. longiligulare, A. krekrevanh, A. villosum (Ping, 2004; Hong, 2005), A. subulatum и Amomum sp.[Truong, T.B.P. In vitro propagation of Amomum sp.in A Luoi district, Thua Thien Hue province / T.B.P. Truong, T.B.K. Than, D.T. Nguyen et al. // Hue University Jouranl of Science Natural Science. - 2017. - Vol. 126(1D). - P. 37-52]. Что касается черного кардамона (A. tsao-ko), то исследования такого плана с данным видом ранее не проводились.

Известен способ клонального микроразмножения белого кардамона (A. villosum Lour.) [Hong, Н. Tissue culture and plantlet regeneration of Amomum villosum / H. Hong, T.L. Na // Plant physiology communications. - 2005. - Vol. 1. - P. 57-61]. Способ заключается в размножении растений in vitro через почки, изолированные с корневищ растений и культивирование их на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС), а также БАП 2 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л, сахарозу 3% и агар 0,8%. Способ предполагает размножение растений через индукцию образования адвентивных почек, формирование микропобегов с последующим переносом их на питательную среду для укоренения (ИМК 1 мг/л). Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения, который составил 3,7 на один первичный эксплант.

Известен способ клонального микроразмножения кардамона сиамского (A. Krervanh) [Tefera, W. Micropropagation of Krawan (Amomum krervanh Pierre ex Gagnep) / W. Tefera, S Wannakrairoj // Science Asia. - 2004. - Vol. 30. - P. 9-15], включающий культивирование почек, изолированных с корневищ растений, на питательной среде МС, содержащей различные цитокинины (БАП, кинетин или тиадиазурон) в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой (0,5 мг/л). В предлагаемых условиях выращивания наблюдается формирование из почек главного и адвентивных побегов. Недостатком предлагаемого способа является низкий выход асептической культуры (15,4%), так как изолированные почки сильно заражены микроорганизмами.

Известен способ размножения in vitro Elettaria cardamomum [Dahanayake, N. Application of seed treatments to increase germinability of cardamom (Elettaria cardamomum) seeds under in vitro conditions / N. Dahanayake // Sabaragamuwa University J. - 2015. - Vol. 14(2). - P. 101-107], заключающийся в культивировании семян на питательной среде Уайта и получение асептических проростков, из которых в дальнейшем на среде для регенерации (питательная среда, содержащая минеральные соли по прописи МС, 1 мг/л кинетин, 1 мг/л ИУК, 3% сахарозу и 0,7% агара) наблюдается формирование нормальных по морфологии побегов. Основной способ размножения - индукция образования адвентивных почек в базальной части микропобегов. Недостатком способа является использование семян, имеющих плотную оболочку, которая затрудняет их прорастание и всхожесть семян не превышает 5,9%. Кроме того, предлагаемый способ предусматривает низкий коэффициент размножения.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится способ клонального микроразмножения черного кардамона (A. tsao-ko) [Кухат К.В., Нгуен Х.Т., Калашникова Е.А., Киракосян Р.Н. Экспериментальный морфогенез Amomum tsao-ko Crevost & Lemarie в культуре in vitro // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2022. -25(7): 16-21] с использованием в качестве объекта исследований семена, которые после поверхностной стерилизации 0,1% раствором хлорида ртути (HgCl₂) в течение 10 минут промывали в стерильной дистиллированной воде, затем проводили механическую скарификацию (скальпелем надрезали семена) и переносили на безгормональную питательную среду МС с последующей пересадкой сформировавшихся проростков на среду для размножения (минеральные соли по прописи МС+4 мг/л БАП+0,5 мг/л НУК). На этапе укоренения используют питательную среду МС, содержащую 0,5 мг/л ИМК. Недостатком способа является низкий выход асептических проростков из семян (6,94%), проявление бактериальной инфекции при скарификации семян, а также невысокий коэффициент размножения (5,42).

В результате анализа литературных данных и патентного поиска установлено, что исследования, направленные на разработку способа размножения in vitro черного кардамона с использованием вегетативных органов - отсутствуют. Причем, при разработке способа размножения, в качестве первичного материала необходимо предпочтение отдавать вегетативным органам растений, а не семенам, которые не всегда передают ценные свойства и признаки растения-донора. Использование вегетативных органов растений позволяет получать высококачественный, генетически однородный посадочный материал.

Задача предлагаемого изобретения - разработать способ клонального микроразмножения черного кардамона (A. tsao-ko) за счет использования вегетативных частей растения.

Технический результат изобретения - обеспечение ускоренного получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала.

Поставленная задача и заявленный технический результат достигается за счет того, что в качестве первичного экспланта используют сегменты корневищ со спящими почками, которые после поверхностной стерилизации культивируют на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 5, 95 - P. 473-497] до образования микропобегов длиной 1,5-3 см, после чего их переносят на питательную среду МС, содержащую 1 мг/л БАП в сочетании с 1 мг/л ИУК, 3% сахарозы и 0,8% агара, на которой наблюдается образование адвентивных почек и корней. Выращивают микропобеги в условиях световой комнаты, где поддерживается температура 25°С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 5000 лк. Сформированные в условиях in vitro микроклоны переносят для адаптации в условия ex vitro, в качестве субстрата используют биогрунт.

Известных в научно-технической и патентной литературе способов с использованием корневых эксплантов и аналогичным составом питательной среды не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением питательной среды для размножения in vitro и почвенного субстрата для адаптации ex vitro черного кардамона не достигался в известных решениях.

Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.

В качестве первичного экспланта использовали сегменты корневища, изолированные с интактных растений черного кардамона, содержащие спящие почки. Перед введением в культуру in vitro сегменты корневища А. tsao-ko разрезают на отдельные узловые сегменты длиной 3,0-5,0 см. Затем их промывают проточной водопроводной водой в течение 15-20 минут, после чего острым лезвием удаляют внешние чешуи и очищенные сегменты погружают в 1%-ный мыльный раствор (мас/об) на 10 минут и затем промывают под проточной водопроводной водой. Последующие действия проводят в условиях ламинар-бокса. Сегменты корневищ помещают в марлевые мешочки и переносят в ламинар-бокс, где проводят поверхностную стерилизацию 70%-ным этанолом в течение 30 секунд с последующим погружением в 0,1%-ный раствор хлорида ртути (HgCl₂) на 15 минут. После этого корневища промывают стерильной дистиллированной водой 4-5 раз и высаживают в 200 мл культуральные сосуда на агаризованную питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС). рН питательной среды МС доводят до 5,8 перед автоклавированием. В этих условиях корневища выращивают в течение 6 недель до образования из спящих почек побегов (1,5-3 см), после чего побеги отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на питательной среде МС, содержащей 1 мг/л БАП, 1 мг/л ИУК, 3% сахарозы и 0,8% агара. В этих условиях в течение 5 недель формируется основной побег (до 5 см), а также образуются в базальной части побега адвентивные почки (в среднем на один побег до 6, 7 шт.), которые отделяют и самостоятельно культивируют на вышеуказанной среде, на которой вновь формируется главный побег и адвентивные почки. На этом этапе наблюдается формирование не только микропобегов, но и корней, что приводит к ускорению получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала, за счет сокращения третьего этапа клонального микроразмножения - укоренение. Сформированные в условиях in vitro микроклоны переносят для адаптации в условия ex vitro, в качестве субстрата используют биогрунт (производитель «Фаско»).

Изобретение проиллюстрировано на рисунках.

На фиг. 1 появление бактериального заражения на корневище A. tsao-ko после стерилизации этиловым спиртом.

На фиг. 2 асептическая культура A. tsao-ko после стерилизации 0,1% HgCl₂ в течение 15 минут.

На фиг. 3 формирование побегов из спящих почек (после 6 и 8 недель культивирования соответственно).

На фиг. 4 образование адвентивных почек в базальной части микропобегов.

На фиг. 5 образование корневой системы на этапе микроразмножения.

На фиг. 6 адаптация микроклонов A. tsao-ko к условиям ex vitro.

Пример 1. Для получения стерильной культуры корневищ применяли ступенчатую стерилизацию. Перед введением в культуру in vitro сегменты корневища A. tsao-ko разрезают на отдельные узловые сегменты длиной 3,0-5,0 см. Затем их промывают проточной водопроводной водой в течение 15-20 минут, после чего острым лезвием удаляют внешние чешуи и очищенные сегменты погружают в 1%-ный мыльный раствор (мас/об) на 10 минут и затем промывают под проточной водопроводной водой. Последующие действия проводят в условиях ламинар-бокса. Сегменты корневищ помещают в марлевые мешочки и переносят в ламинар-бокс, где проводят поверхностную стерилизацию 70%-ным этанолом в течение 30 секунд с последующим погружением в 0,1%-ный раствор хлорида ртути (HgCl₂). Временная экспозиция хлорида ртути была 5, 12 и 15 минут. В качестве контроля корневища обрабатывали этиловым спиртом (70%) в течение 1 минуты. После этого корневища промывают стерильной дистиллированной водой 4-5 раз и высаживают в 200 мл культуральные сосуда на агаризованную питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС). Оценивали количество стерильных и зараженных корневищ. Основные результаты приведены в таблице 1 и рисунках 1 и 2.

На основании проведенных исследований установлено, что наибольший выход стерильных эксплантов (80%) был получен при временной экспозиции воздействия хлорида ртути на сегменты корневищ 15 минут. В этом варианте из спящих почек формировались побеги с ярко-зеленой листовой пластинкой правильной морфологии. Использование этилового спирта в качестве стерилизатора было не эффективно.

Пример 2. Стерилизацию корневищ проводили по методике, описанной в примере 1. После поверхностной стерилизации, корневища разделяли на сегменты и культивировали на питательной среде МС, содержащей различные регуляторы роста. Исследовали влияние 0,5-2 мг/л БАП или 0,5-2 мг/л кинетина в сочетании с 1 мг/л ИУК на биометрические показатели побегов и коэффициент размножения, результаты приведены в таблице 2 и на рисунках 3 и 4.

На основании проведенных экспериментов установлено, что исследуемые цитокинины и концентрации оказывают стимулирующий эффект на индукцию образования адвентивных побегов. Причем, действие БАП в разных концентрациях превышало действие кинетина. Так, наилучшие результаты были получены в варианте присутствия БАП в питательной среде в концентрации 1 мг/л. В этом варианте коэффициент размножения было максимальным и составило 6,70, а средняя длина побегов - 5,85 см. Побеги характеризовались быстрым ростом, имели ярко-зеленый цвет стеблей и листовых пластинок. На этом этапе наблюдалось формирование адвентивных корней, что ускоряет процесс клонального микроразмножения за счет отсутствия третьего этапа технологии.

Пример 3. Получение микрорастений проводили по методике, описанной в примере 2. Сформировавшиеся микрорастения извлекали из питательной среды, тщательно промывали корневую систему в проточной водопроводной воде и затем обрабатывали 0,5%-ным раствором Бавистина в течение 10 минут. Последняя операция была необходима для предотвращения грибкового заражения. Далее микроклоны были перенесены в почвенный субстрат. В эксперименте использовали два типа почвы: Грунт универсальный (производитель «Garden star»), содержащий питательные вещества (мг/100 л) N-300, Р-300, K-400 и Биогрунт (производитель «Фаско»), состоящий из высокогорного и низинного торфа, песка, биогумуса, доломитовой муки и полного минерального удобрения. Выживаемость микроклонов регистрировалась через 1 и 3 месяца после пересадки в условия ex vitro. Результаты приведены в таблице 3 и на рисунке 6.

На основании полученных результатов установлено, что выживаемость микроклонов черного кардамона зависит от применяемого типа почвы. Так, из двух изученных вариантов почв, наилучшие результаты по адаптации, а так же по биометрическим показателям растений-регенерантов были получены при выращивании растений в биогрунте фирмы «Фаско». В этом варианте средняя выживаемость микроклонов составила 83,3% (через 1 месяц после высадки в почву), что на 10%) выше при использовании грунта универсального фирмы Garden star. Преимущества биогрунта фирмы «Фаско» были установлены и по биометрическим показателям микроклонов. В этих условиях растения-регенеранты характеризовались активным ростом и высота побегов была в среднем в 2 раза больше (23,3 см), чем при использовании грунта универсального (13,6 см). Аналогичная тенденция сохранялась и при учете такого показателя, как количество листьев на одно растение. В варианте с биогрунтом фирмы «Фаско» среднее количество листьев составило 5,7 шт., что на 25% больше, чем во втором варианте (грунт универсальный).

В результате проведения цикла исследований был разработан способ клонального микроразмножения черного кардамона (A. tsao-ko), включающий культивирование сегментов корневищ на питательной среде МС, содержащей 1 мг/л БАП в сочетании с 1 мг/л ИУК, 3% сахарозу и 0,8% агара при выращивании в условиях световой комнаты, где поддерживается температура 25°С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 5000 лк. Для адаптации микроклонов к условиям ex vitro используют субстрата Биогрунт (производитель «Фаско»).

Предлагаемый способ микроразмножения черного кардамона in vitro сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать его в практической работе и для получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала растений семейства Имбирные:

1. Технология предполагает получение генетически однородный материал за счет образования побегов непосредственно на первичном экспланте, минуя образование каллусной ткани.

2. Технология предполагает проведение работ по размножению и получению ценного посадочного материала в лабораторных условиях не зависимо от сезона и негативных факторов окружающей среды.

3. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогостоящего оборудования и питательных сред.

4. Предлагаемый способ размножения предполагает ускоренное получение высококачественного, генетически однородного посадочного материала, за счет отсутствия третьего этапа клонального микроразмножения - укоренения.

5. Предлагаемый способ является универсальным для клонирования растений семейства Имбирные.

Заявляемое изобретение направлено на разработку способа клонального микроразмножения черного кардамона (A. tsao-ko) с использованием в качестве первичного экспланта вегетативных частей растений - корневищ. Известных в научно-технической и патентной литературе способов размножения черного кардамона in vitro с использованием корневых эксплантов и аналогичным составом питательной среды при размножении и адаптации ex vitro не обнаружено.

По сравнению с прототипом изобретение обеспечит ускорение получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения и относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и лекарственных растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала кардамона черного (Amomum tsao-ko). Микрорастения получают из корневищ растений, которые после поверхностной стерилизации культивируют на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно включают 1 мг/л БАП и 1 мг/л ИУК, 3% сахарозы и 0,8% агара, на которой наблюдается образование адвентивных почек и корней. Выращивают микропобеги при температуре 25°С, в 16-часовой фотопериод, при освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 5000 лк. Для адаптации микроклонов к условиям ex vitro используют биогрунт. Изобретение позволяет обеспечить ускоренное получение высококачественного, генетически однородного посадочного материала. 6 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ клонального микроразмножения черного кардамона (Amomum tsao-ko), включающий получение микрорастений в условиях in vitro из асептических сегментов растений черного кардамона, отличающийся тем, что микрорастения получают из сегментов корневищ черного кардамона, культивируя на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно включают 1 мг/л БАП и 1 мг/л ИУК, 3% сахарозы и 0,8% агара, при температуре 25°С, 16-часовом фотопериоде, освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 5000 лк, адаптируют микроклоны к условиям ex vitro используя биогрунт.