СПОСОБ ОЦЕНКИ СПОСОБНОСТИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ К ПРОДУКЦИИ И СЕКРЕЦИИ МОНООКСИДА АЗОТА Российский патент 2000 года по МПК A61B5/21 G01N33/84 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-лабораторной диагностике, и позволяет определить способность эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции монооксида азота (NO), что может быть использовано для установления роли гипо- или гиперпродукции NO сосудистым эндотелием в развитии атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни, сахарного диабета и др., прогноза их дальнейшего течения и коррекции проводимой терапии.

Известны способы определения содержания нитрат-ионов в различных средах (авторское свидетельство СССР N 658083, C 01 B 21/38, 06.01.76; авторское свидетельство СССР N 798036, C 01 B 21/38, F 01 N 21/27, 23.01.81; авторское свидетельство СССР N 929544, C 01 B 21/38, G 01 N 21/77, 23.05.82).

Однако эти способы рекомендованы для определения больших концентраций нитратов (от 300 мг и выше), не могут быть применены для сред, содержащих ионы Fe²⁺ и Cl^-, могут быть проведены только при высоких температурах (+70.. . +100^oC), требуют для своего осуществления больших количеств исследуемого материала (до 27 мл), что ограничивает использование данных способов для определения содержания NO (по концентрации нитрат-ионов) в крови.

Известен также способ количественного определения нитратов/нитритов в биологических жидкостях (Grisham M.B., Johnson G.G., Lancaster J.R. Measurement of nitrate and nitrite in extracellular fluids. Methods Enzymol.- 1996. - v.268.- 237-246). Способ заключается в спектрофотометрическом определении в биологических жидкостях концентрации нитратов/нитритов, образовавшихся из NO под действием фермента нитратредуктаза. Способ осуществляют следующим образом. Для исследования используют мочу пациента или его бестромбоцитарную плазму, полученную при центрифугировании гепаринизированной (40 МЕ/мл) крови. Производят приготовление следующих реактивов:
раствор нитратредуктазы в концентрации 10 ед/мл приготавливают путем растворения в дистиллированной воде при постоянном перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре, раствор хранят при -70^oC;
1M Hepes буфер (pH 7,4), хранят при +4^oC;
раствор лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в концентрации 1500 ед/мл, хранят при -20^oC;
реактив Greiss'а приготавливают путем смешивания равных количеств 0,2% раствора нафтилендиамина в 5% растворе фосфорной кислоты и 2% раствора сульфаниламида в 5% растворе фосфорной кислоты, раствор хранят при +4^oC;
0,1 мМ раствор флавинадениндинуклеотида (ФАД);
1 мМ раствор никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) готовят и хранят в течение исследования в посуде темного стекла;
100 мМ раствор пировиноградной кислоты;
раствор протамина сульфат в концентрации 10 мг/мл.

Растворы ФАД, НАДФ, пировиноградной кислоты и протамина сульфата готовят в день исследования, хранят в течение исследования на льду и не используют на следующий день.

Исследование проводят в несколько этапов:
к 100 мкл исследуемого материала, инкубируемого при +37^oC, добавляют 10 мкл раствора нитратредуктазы, 25 мкл Hepes буфера, 5 мкл раствора ФАД и 50 мкл раствора НАДФ;
к полученной смеси добавляют 5 мкл раствора ЛДГ и инкубируют в течение 10 мин при +37^oC;
если в качестве исследуемого материала используют бестромбоцитарную гепаринизированную плазму крови, то для удаления гепарина к смеси добавляют 100 мкл раствора протамина сульфата, инкубируют смесь в течение 5 мин при комнатной температуре и затем для осаждения нерастворимого комплекса гепарин-протамина сульфат центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин при +25^oC, прозрачный супернатант переносят в чистую сухую пробирку. Если в качестве исследуемого материала используют мочу, то добавление раствора протамина сульфата не производят;
к супернатанту добавляют 1 мл реактива Greiss'а и инкубируют полученную смесь в течение 10 мин при комнатной температуре;
производят спектрофотометрию полученного образца при длине волны 543 нм относительно контрольного образца, который вместо 100 мкл исследуемого материала содержит 100 мкл дистиллированной воды;
конечную концентрацию нитратов/нитритов в биологической жидкости, по которой судят о содержании в ней NO, определяют с помощью предварительно построенной калибровочной кривой и с учетом коэффициента разведения исследуемого материала (для мочи он равен 5, а для бестромбоцитарной гепаринизированной плазмы крови - 6). Калибровочная кривая представляет собой график соотношения различных концентраций нитратов/нитритов (25, 50, 125 и 250 мкл 0,1 мМ растворов нитрата натрия и нитрита натрия) и величин оптической плотности образцов, содержащих нитрат натрия и нитрит натрия в указанных концентрациях;
полученную величину содержания NO в исследуемом материале сравнивают с величиной этого показателя в контрольной группе.

Однако, определяя содержание NO в плазме крови или в моче только в фиксированный момент времени, способ не позволяет получить объективную информацию о процессах синтеза и выделения NO в организме, так как содержание NO в жидкостях организма может колебаться в различные моменты времени в значительных пределах в зависимости от многих случайных факторов (эмоциональный фактор, недозированная физическая нагрузка, курение, употребление в пищу продуктов, содержащих нитраты, и т.д.)
Известен также способ исследования эндотелиальной регуляции сосудистого тонуса, заключающийся в оценке влияния фармакологического стимула на диаметр сосуда и/или кровоток по нему, - проба с ацетилхолином при коронарографии (Veung A. C. , Yekshtein V.I., Krantz D.S. et al. The effect of atherosclerosis on the vasomotor response of coronary arteries to mental stress. N.Engl.J.Med., 1991.- v.325.- 1551-1556; Nabel E.G., Selwyn A. P., Ganz P. Large coronary arteries in human are responsive to changing blood flow: an endothelium-dependent mechanism that fails in patients with atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol, 1990.- v. 16.- 349-356). Способ заключается в том, что после катетеризации коронарных артерий и оценки исходных ангиограмм интраартериально вводят раствор ацетилхолина (ацетилхолин опосредует свое сосудорасширяющее действие через выделение NO) в возрастающих дозах и после введения каждой дозы измеряют диаметр сосуда в заданных сегментах и определенных проекциях, либо определяют скорость и объем кровотока в коронарных артериях методом допплерографии с использованием датчика, расположенного на кончике интракоронарного катетера.

Однако коронарографическое исследование - дорогостоящий и не всегда доступный способ исследования функциональной активности эндотелия, требующий соблюдения условий оперативного вмешательства.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ оценки функции эндотелия периферических артерий, заключающийся в определении изменения диаметра сосуда в условиях реактивной гиперемии (Anderson Е.А., Mark A.L. Flow-mediated and reflex changes in large peripheral artery tone in humans. Circulation, 1989.- v.79.- 93-100; Sinoway L.I., Hendrickson C., Davidson W. R. et al. Characteristics of flow-mediated brachial artery vasodilatation in human subjects. Circulat. Res. , 1989.- v.64.- 32-42). Способ осуществляют следующим образом. После пребывания пациента в течение 10-15 мин в горизонтальном положении определяют с помощью ультразвуковых методик диаметр исследуемой периферической артерии. Затем стимулируют эндотелий-зависимую дилатацию артерии созданием реактивной гиперемии. Для этого сначала осуществляют компрессию кровеносных сосудов: в манжете тонометра, наложенной на конечность пациента дистальнее исследуемого участка, в течение 4-10 мин создают давление 200 - 300 мм рт.ст. Затем осуществляют декомпрессию сосудов, при этом в проксимальном сегменте артерии увеличиваются кровенаполнение и скорость кровотока, - развивается реактивная гиперемия. Через 30-90 с после декомпрессии повторяют определение диаметра артерии. Нормальной реакцией плечевой артерии считают ее дилатацию на фоне реактивной гиперемии более чем на 10% от исходного диаметра. Меньшее ее значение или вазоконстрикцию считают патологическими. Через 15 мин (по мере восстановления исходного диаметра сосуда) проводят контрольную пробу с введением эндотелий-независимых вазодилататоров, например экзогенных нитратов (нитроглицерина, нитросорбида, нитропруссида натрия), которые всегда вызывают расширение сосудов, так как действуют непосредственно на гладкую мускулатуру сосудистой стенки.

Однако данный способ характеризует функциональную активность эндотелия, обусловленную продукцией и секрецией эндотелиоцитами целого ряда вазодилататоров: NO, эндотелиального фактора гиперполяризации, простациклина, натрийуретического пептида типа C, адреномедулина, и не позволяет установить наличие гипо- или гиперпродукции NO эндотелием сосудистой стенки.

Кроме того, для своего осуществления способ требует наличия дорогостоящей аппаратуры для ультразвуковых исследований.

Задачей заявляемого способа является устранение названных недостатков и разработка способа, позволяющего выявить гипо- или гиперпродукцию NO эндотелием сосудистой стенки.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе оценки способности эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции NO, включающем стимуляцию секреции эндотелий-зависимых вазодилататоров при компрессии кровеносных сосудов наложением на конечность манжеты тонометра (сфигмоманометра) и созданием в ней давления, величина которого превышает величину систолического артериального давления, ситуацию синтеза и секреции NO моделируют путем создания очага кратковременной локальной ишемии, для чего у пациента и в контрольной группе осуществляют компрессию кровеносных сосудов проксимальнее исследуемого участка, производят взятие крови и определение содержания в ней NO до и после компрессии кровеносных сосудов, вычисляют разность полученных величин у пациента в сравнении с данными в контрольной группе, по которой судят о способности эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции NO; содержание NO в крови оценивают по концентрации нитратов/нитритов, для чего после взятия крови производят подготовку исследуемых проб крови и реактивов, способных трансформировать NO в нитраты/нитриты, построение калибровочной кривой зависимости оптической плотности от заданных концентраций нитратов/нитритов, смешивание проб с реактивами, определение оптической плотности полученных образцов с последующим вычислением концентрации нитратов/нитритов в пробах с учетом значений калибровочной кривой; в качестве антикоагулянта при взятии крови используют 3,8% раствор цитрата натрия.

Заявляемый способ заключается в следующем. После пребывания пациента в течение 10-15 мин в состоянии относительного физиологического покоя на его обнаженную конечность, например на плечо, накладывают манжету тонометра (сфигмоманометра). Взятие крови у пациента производят из вены в месте, расположенном дистальнее места наложения манжеты, иглой с заглушкой. Кровь забирают в количестве 1,5-2 мл и для предотвращения свертывания быстро перемешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9 : 1 (проба 1). Иглу оставляют в пунктируемой вене и закрывают заглушкой. Затем осуществляют компрессию кровеносных сосудов, производя манжеточную пробу. Для этого соединяют манжету с тонометром (сфигмоманометром), определяют величину систолического артериального давления, а затем, нагнетая с помощью резиновой груши воздух в манжету, создают в ней давление, величина которого на 10 мм рт. ст. превышает величину систолического давления. Компрессию кровеносных сосудов осуществляют в течение 3 мин. При этом в участке, расположенном дистальнее места наложения манжеты, формируется очаг кратковременной локальной ишемии - стимул синтеза и секреции NO эндотелием сосудистой стенки. Осуществляют декомпрессию кровеносных сосудов, после чего снова производят взятие крови в количестве 1,5-2 мл и перемешивают ее с антикоагулянтом (проба 2); при этом первые капли крови из иглы в исследуемый материал не забирают. Полученные пробы стабилизированной крови 1 и 2 центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, затем полученную богатую тромбоцитами цитратную плазму крови центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. Для исследования отбирают верхний слой - цитратную бестромбоцитарную плазму крови. В ней определяют содержание NO по концентрации нитратов/нитритов аналогично способу количественного определения нитратов/нитритов в биологических жидкостях (Grisham et al., 1996). При этом из исследования исключают добавление раствора протамина сульфата и, соответственно, используют при вычислении коэффициент разведения, равный 5. Определение содержания NO в каждой из двух проб повторяют 2 - 3 раза и вычисляют средние значения. После этого определяют разность полученных величин - X:
X(%)=X₂(%) - X₁(100%),
где X₁ - содержание NO в плазме крови до компрессии кровеносных сосудов (в пробе 1);
X₂ - содержание NO в плазме крови после компрессии кровеносных сосудов (в пробе 2).

Полученная величина X отражает уровень стимулированной продукции и секреции NO эндотелием сосудистой стенки. Аналогично изложенному выше проводят исследование в группе здоровых лиц (контрольная группа). Для оценки функциональной активности эндотелия сосудистой стенки в отношении NO у пациента величину X сравнивают с таковой в контрольной группе.

Технико-экономический эффект заявляемого способа заключается в получении возможности оценить непосредственно участие эндотелия сосудистой стенки в процессах продукции и секреции NO, так как при компрессии кровеносных сосудов (манжеточная проба) происходит выброс из эндотелиоцитов (в результате механического выдавливания и под влиянием гипоксии) образующихся в них различных биологически активных молекул, в том числе NO. Следовательно, сравнение содержания NO в плазме крови до и после компрессии кровеносных сосудов позволяет определить количество NO, синтезированного эндотелием и секретированного им в кровоток. Кроме того, заявляемый способ не требует использования дорогостоящей аппаратуры для ультразвуковых исследований; не предполагает проведения контрольной пробы с эндотелий-независимыми вазодилататорами.

Использование в качестве антикоагулянта раствора цитрата натрия, а не гепарина, позволяет уменьшить продолжительность биохимической подготовки исследуемого материала к спектрофотометрии за счет выключения из хода исследования этапа, на котором производят добавление к образцу раствора протамина сульфата с последующей инкубацией и центрифугированием полученной смеси для осаждения нерастворимого комплекса гепарин - протамина сульфат, позволяет исключить раствор протамина сульфата из списка необходимых для исследования реактивов.

Кроме того, использование цитратной бестромбоцитарной плазмы крови пациента переводит способ в разряд экономичных, целесообразных, щадящих способов исследования, повышает уровень культуры производства медицинских исследований и технологий, так как позволяет обойтись без специального взятия крови и совместить данное исследование с другими исследованиями, объектом которых служит плазма крови пациента, например, биохимическими, коагулологическими, иммунологическими и другими исследованиями.

Способ может быть использован в медицине, а именно в клинико-лабораторной диагностике, и позволяет определить способность эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции монооксида азота (NО), что может быть использовано для установления роли гипо- или гиперпродукции NО сосудистым эндотелием в развитии атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни, сахарного диабета, и др., прогноз их дальнейшего течения и коррекции проводимой терапии. Ситуацию синтеза и секреции NО моделируют путем создания очага кратковременной локальной ишемии, для чего у пациента и в контрольной группе осуществляют компрессию кровеносных сосудов проксимальнее исследуемого участка, производят взятие крови и определение содержания в ней NО до и после компрессии кровеносных сосудов, вычисляют разность полученных величин у пациента в сравнении с данными в контрольной группе, по которой судят о способности эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции NО. Содержание NО в крови оценивают по концентрации нитратов/нитритов, для чего после взятия крови производят подготовку исследуемых проб и реактивов, способных трансформировать NО в нитраты/нитриты, построение калибровочной кривой зависимости оптической плотности от заданных концентраций нитратов/нитритов, смешивание проб с реактивами, определение оптической плотности полученных образцов с последующим вычислением концентрации нитратов/нитритов в пробах с учетом значений калибровочной кривой. Кроме того, в качестве антикоагулянта при взятии крови используют 3,8% раствор цитрата натрия. Способ более эффективен, экономичен, позволяет обойтись без специального взятия крови. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ выявления способности эндотелия сосудистой стенки к гипо- или гиперпродукции и секреции монооксида азота, включающий стимуляцию секреции эндотелийзависимых вазодилататоров при компрессии кровеносных сосудов наложением на конечность манжеты тонометра (сфигмоманометра) и созданием в ней давления, величина которого превышает величину систолического артериального давления, отличающийся тем, что ситуацию синтеза и секреции монооксида азота моделируют путем создания очага кратковременной локальной ишемии, для чего у пациента и в контрольной группе осуществляют компрессию кровеносных сосудов проксимальнее исследуемого участка, производят взятие крови и определение в ней содержания монооксида азота до и после компрессии кровеносных сосудов по концентрации нитратов/нитритов, вычисляют разность полученных величин у пациента в сравнении с данными в контрольной группе, по которой судят о способности эндотелия сосудистой стенки к гипо- или гиперпродукции и секреции монооксида азота. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта при взятии крови используют 3,8% раствор цитрата натрия.