СПОСОБ СТАНДАРТИЗАЦИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕНИНОВОГО ПРОФИЛЯ У БОЛЬНЫХ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 A61H1/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и предназначено для определения функционального состояния ренин-альдостероновой системы (РАС) у больных с артериальными гипертензиями.

В настоящее время общепринят способ определения функционального состояния РАС по активности ренина плазмы крови (АРП). Однако влияние на секрецию ренина ряда факторов, в частности: изменения активности симпатической нервной системы, почечного перфузионного давления, ретенции ионов натрия и калия, обуславливают необходимость функциональных исследований АРП в базальных условиях и после проведения нагрузочных проб. Причем, если первый этап не представляет никаких технических трудностей, кроме быстрого охлаждения образцов крови до 4^oС, то второй этап (нагрузка) не лишен ряда сложностей.

Для этих целей наиболее часто применяется нагрузочный тест с четырехчасовой ходьбой (Ganguly A. et al., 1973), после проведения которого и в сравнении с показателями, полученными в базальных условиях, судят о рениновом профиле и, соответственно, о функциональной активности ренин-альдостероновой системы.

Этот метод является наиболее близким техническим решением предлагаемого способа и выбран нами в качестве прототипа. Однако этому тесту присущи следующие недостатки:
а) невозможность точно дозировать нагрузку;
б) неодинаковый темп ходьбы, что отражается на качестве выполнения нагрузки;
в) влияние циркадных ритмов на точность получаемых результатов. Последнее положение является особенно важным, поскольку при четырехчасовой нагрузке второй забор крови приходится обычно на 13 часов, а в это время происходит физиологическое снижение активности ренина плазмы крови и, следовательно, РА системы.

Указанные недостатки устраняются применением велоэргометрической нагрузки (ВЭМ).

Способ заключается в следующем:
1. Проводят пробу с велоэргометрической нагрузкой.

2. Забирают венозную кровь, центрифугируют для получения плазмы, инкубируют с меченым ¹²⁵I ангиотензином I и антисывороткой к нему, подсчитывают радиоактивность полученного комплекса с последующим вычислением концентрации.

Способ осуществляется следующим образом: для определения базальной секреции ренина в период с 9 до 9³⁰ часов утра однократно отбирают пробу венозной крови из кубитальной вены. Затем больным проводится ведоэргометрический тест с выполнением нагрузки в 100 Вт в течение 3 минут, после которой осуществляется повторный забор крови.

На протяжении всего периода нагрузки оцениваются субъективные ощущения больного, динамика электрокардиограммы (по осциллоскопу), измеряется АД по методу Короткова. Проба проводится до 10³⁰ часов утра, т. е. во время пика биоактивности РАС.

Образцы крови центрифугируют на рефрижераторной центрифуге в течение 10 минут при температуре 4^oС. Полученную плазму разливают на аликвоты по 0,5 мл в пластиковые пробирки. Далее в каждую из них добавляют по 0,01 мл энзиматического ингибитора и 0,05 мл буфера. Перемешивают содержимое пробирок с помощью смесителя. Из каждой пробирки отбирают по 0,2 мл полученной смеси и переносят в две пробирки "второго ряда", первую из которых помещают на 90 минут в ледяную баню ("пустая"), а вторую - в термостат (37^oС), а после инкубации - также на 2-3 минуты в ледяную баню.

Готовят ряд реакционных пробирок из расчета: две пробирки - для определения общей активности меченого ¹²⁵I ренина; 12 пробирок - для построения калибровочной кривой, по две пробирки на каждую анализируемую пробу. В калибровочные пробирки с антителами против ренина вносят по 0,05 мл стандартов ренина, содержащих соответственно 0, 0,2, 0,7, 2, 7, 35 нг/мл соответственно, а в опытные - по 0,05 мл содержимого пробирок "второго ряда".

Во все пробирки вносят по 0,5 мл меченого ¹²⁵I ренина. Перемешивают содержимое пробирок с помощью вихревого смесителя и инкубируют 16-18 часов при температуре 18-25^oС.

После окончания инкубации все пробирки (за исключением проб для определения общей внесенной активности) декантируют.

Определяют скорость счета радионуклида ¹²⁵I в каждой пробирке на гамма-счетчике. Время счета - одна минута.

Рассчитывают среднее арифметическое значение скорости счета радионуклида ¹²⁵I в каждой паре пробирок: с общей внесенной активностью-Т, калибровочными пробами - В(0), В(0,2), В(0,7), В(2), В(7), В(35) и образцами пациентов.

Строят в линейных координатах калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс концентрацию ренина в калибровочной пробе, а по оси ординат - соответствующее среднее значение скорости счета. Через полученные точки проводят плавную кривую.

Определяют содержание ренина в анализируемых пробах. Для этого по оси ординат откладывают среднее арифметическое значение скорости счета радионуклида ¹²⁵I в пробирках, содержащих пробы пациентов. Через полученую точку проводят прямую, параллельную оси абсцисс, где определяют значение концентрации ренина в анализируемой пробе. Аналогично определяют содержание ренина в пробирках, не подвергавшихся инкубации в термостате ("пустых").

Далее вычисляют активность ренина плазмы крови у данного пациента по следующей формуле:

где Iп - концентрация ренина плазмы крови в пробирке, инкубируемой в течение 90 минут при температуре 37^oС;
IIп - концентрация ренина плазмы крови в пробирке, инкубируемой в течение 90 минут при температуре 4^oС;
1,12 - фактор разбавления образцов (при добавлении ингибитора и буфера);
1,5 - время инкубации в часах.

Например, пусть концентрация ренина плазмы в пробирке, подвергнутой инкубации при 37^oС, составила 1,7 нг/мл, а концентрация ренина в пробирке, подвергнутой инкубации при 4^oС, - 0,3 нг/мл. Тогда, согласно приведенной выше формуле, получаем - 1,05 нг/мл/ч.

Соответствующим образом вычисляется активность ренина плазмы крови и у других пациентов.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволило установить соответствие его критерию "новизна".

При изучении других технических решений в данной области технические признаки, отличающие заявляемый способ от прототипа, не были выявлены и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию "существенные отличия".

Для определения среднего уровня нагрузки, после выполнения которой достигается максимальная стимуляция РАС, уровень которой сопоставим с нагрузкой ходьбой, была проведена клиническая проверка по определению АРП на ступенях нагрузки в 50, 100 и 150 Вт, а на следующий день - после четырехчасовой ходьбы. Анализировались данные в группе здоровых (18 человек) и больные I-II стадии (21 человек). Полученные результаты представлены в таблице.

Как видно из представленных данных, статистически значимое (р<0,05) повышение АРП у здоровых лиц наблюдалось при нагрузке 100 Вт и выше, а в группе больных - при нагрузке 50-100 Вт с последующим снижением АРП по мере роста мощности нагрузки. Максимальная степень стимуляции РАС развивалась при уровне нагрузки 100 Вт (у здоровых 1,93±0,48 нг/мл/ч - от 0,49 до 3,37, у больных - 2,57±0,47 - от 1,16 до 3,98).

При выполнении пробы с четырехчасовой ходьбой повышение АРП отмечалось в обеих группах, но оно было менее значимым. Кроме того, для теста с ходьбой была характерна большая вариабельность данных (средняя ошибка в 1,4 раза больше, чем при нагрузке 100 Вт), что снижает качество теста; меньшая, чем при ВЭМ стимуляции АРП объясняется влиянием циркадного ритма.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет точно дозировать нагрузку, значительно сокращает время ее выполнения, повышает качество, мониторирует состояние сердечно-сосудистой системы в реальном масштабе времени, устраняет влияние циркадных ритмов (проводится на пике функциональной активности ренин-альдостероновой системы), снижает вариабельность получаемых данных.

Источники информации
l. Ganguly A., Dowdy A.I., Luestscher I.A., Melada G.A. Anomalous postural responsen of plasma aldosteron concentration in patients with aldosteron-producing adrenal adenome. - J. Clin. Endocr. Metab., 1973, vol. 36, N 2, pp. 401-404.

2. Ganguly A. , Luestscher I. A., Melada G.A., Dowdy A.I. Control of plasma aldosterone in primary aldosteronism: distinction between adenoma and hyperplasia. - J. Clin. Endocr. Metab., 1973, vol.37, N 5, p. 765-775.

Способ может быть использован в области медицины, а именно в кардиологии, и предназначен для определения функционального состояния ренин-альдостероновой системы у больных с артериальными гипертензиями. Способ включает двукратное определение активности ренина плазмы крови до и после выполнения ступени велоэргометрической нагрузки в 100 Вт в течение 3 мин. Способ повышает точность, сокращает время выполнения, снижает вариабельности получаемых данных. 1 табл.

Способ определения ренинового профиля у больных с артериальной гипертензией, включающий проведение нагрузочной пробы, отличающийся тем, что в качестве нагрузочной пробы используют велоэргометрический тест в течение трех минут с выполнением нагрузки в 100 Вт.