ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K35/78 A61P37/02 A61K35/78 A61K31/4415 A61K31/355 A61K31/45 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к новым лекарственным препаратам иммуностимулирующего и адаптогенного действия и способам их получения.

Известны химические и биохимические иммуностимуляторы, в частности тималин, нуклеинат натрия, продигиозан и т.п.

Препараты выпускают в виде порошка, который либо принимается перорально, либо разводится, например физиологическим раствором, и используется внутримышечно (Земсков Ф.М. и др. Иммунология, 1981, N1, С.52-55, Морозов В.Г. и др. ДАН СССР, 1977, т. 233, N3, С.491-494, Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., Медицина,1993, т.2, с. 169-177).

Недостатком препаратов является относительно невысокая эффективность при пероральном применении, а также, как правило, наличие негативных воздействий на человека, возникающих в результате побочных биохимических процессов, возникающих в организме в ходе превращений химических соединений, входящих в лекарственный препарат.

Известно использование в качестве иммуностимуляторов и адаптогенов препаратов природного происхождения, в частности растворов и настоек элеутерококка, облепихи, котовника, мумие, прополиса и т.п. (В.И.Машанов, А.А.Покровский Пряно-ароматические растения, М., Агропромиздат, 1991, И.С. Соколова и др. Дикорастущие и культурные растения, М., Медицина, 1990).

Для всех указанных препаратов характерна относительно невысокая активность, обусловленная во многом низкими концентрациями активного начала в растворе.

Одним из перспективных источников сырья для получения лекарственных препаратов являются зародыши пшеницы (ЗП). В настоящие время их широко используют в качестве биологически активной добавки (БАД) в пищевые и кормовые смеси, а также в косметические средства (пат. ГДР N 50525, 1966, кл. A 21 d, пат. РФ N 2059434, 1993, кл. В 02 С 9/04, пат. РФ N 2040929, 1992, кл. А 61 К 7/047; пат. РФ N 2099978, 1996, кл. А 23 L 1/30, пат.РФ N 2115340, 1997, кл. А 23 L 1/30).

Недостатком всех указанных решений являлась невысокая лекарственная активность зародышей пшеницы, не прошедших глубокую переработку.

Известен водосодержащий экстракт, получаемый из гидролизата предварительно обезжиренных ЗП, который после многостадийной очистки содержит в физрастворе 10 мг/мл пиримидиновых нуклеотидов. (пат. РФ N 2071263, 1997, кл. А 23 К 1/00). Препарат оказывает тормозящее воздействие на развитие гиперактивных клеток (пат.РФ N 2102985, 1998, кл. А 61 К 31/505),однако не обладает иммуностимулирующим и адаптогенным воздействием на организм.

Прототипом настоящего технического решения является наиболее широкоизвестный иммуномодулятор и адаптоген - препарат женьшеня, представляющий собой водный или водно-спиртовой экстракт биологически активных веществ, распределенный в фармацевтически приемлемом растворителе (воде или водно-спиртовом растворе) (А.А.Комаров. Тайна целебных трав, М., Рипол, 1996, с. 154).

Недостатком препарата является значительное количество противопоказаний, ограниченный спектр применения,
Известна технология получения биологически активных добавок (БАД) на основе переработки ЗП, включающая в себя обезжиривание ЗП ацетоном, сушку зародышей и их обработку фосфатным буфером (Н.И.Проскуряков, Т.Н. Нуждина, Научные доклады Высшей школы, Биол. Науки,1960, N2, с. 148-152).

Полученный продукт проявлял каталитические свойства, однако его эффективность была сравнительно невелика, при этом наличие иммуностимулирующих и адаптогенных свойств не отмечалось.

Прототипом заявляемого изобретения в отношении способа получения препарата на основе ЗП является способ, заключающийся в предварительном удалении из ЗП маслорастворимых компонентов обработкой исходного сырья хлорофором, удалении раствора хлороформа, высушивании обезжиренных зародышей, получении гидролизата ДНК кислотным гидролизом на кипящей водяной бане в течение 1 часа, отделении осадка центрифугированием при 1000g в течение 15 мин, нейтрализации раствора и выведении из него пуриновых оснований с дальнейшим использованием полученного раствора, содержащего 10 мг/мл пиримидиновых нуклеотидов с физиологическим раствором для пищевых и кормовых целей в дозе 50-150 мл на прием (пат. РФ N 2071263, 1997, кл. А 23 К 1/00).

При использовании данного способа в конечном препарате отсутствует основная гамма характерных для ЗП БАД, в частности исключаются ценные маслорастворимые компоненты, что приводит к получению препарата с ограниченной областью его применения. Кроме того, заявляемая технология является многостадийной и достаточно трудоемкой.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание эффективного препарата для перорального применения, обладающего более широким спектром биологической активности, в частности иммуностимулирующим и адаптогенным действием, на основе зародышей пшеницы и технологии его получения.

Особенностью проблемы получения препарата, содержащего широкий спектр БАД из данного сырья, являлось значительное количество жиров, содержащихся в ЗП, что создавало большие проблемы на стадии разделения компонентов, в частности по существующим технологиям проблема создания производственного процесса по относительно простой технологии, обеспечивающего очистку экстракта от маслосодержащей клетчатки, до настоящего времени не решена.

Авторами было предложено для решения данной задачи осуществлять экстракцию 30-50% водным этиловым спиртом при комнатной температуре в течение по крайней мере 20 минут с последующим отделением экстракта декантацией и/или фильтрацией и удалением белковой клетчатки из экстракта, нагреванием его в течение по крайней мере 40 мин при 60-70^oC.

Полученный после отделения осадка продукт очищался пропусканием через активированный уголь.

В ходе использования в качестве экстрагента 30-50% водного этанола удается в течение 20-30 минут перевести водорастворимые вещества в раствор, а основные маслорастворимые компоненты в гидратированные комплексы, диспергированные в растворителе.

При использовании меньших концентраций этанола не удается достичь образования вышеуказанных комплексов и получаемый продукт содержит недостаточное количество маслорастворимых ингредиентов, при больших концентрациях этанола снижается содержание водорастворимых биоактивных компонентов (витамина B6, ферментов и т.п.) в препарате.

Условия термообработки были подобраны таким образом, чтобы разрушить дисперсию клетчатки в растворе и вызвать денатурацию белков, не разрушив гидратированные комплексы БАД. При более низкой температуре выделение клетчатки и белков осуществляется в неполной мере, при более высокой температуре происходит снижение содержания ферментов и витамина B6 в препарате.

Отделение экстракта на всех стадиях осуществляется в максимально мягких условиях, чтобы избежать потерь ценных компонентов. Основными используемыми методами является отстаивание взвеси с последующей декантацией или фильтрование, например через слой ЗП.

Оптимальным является сочетание обоих методов, например использование декантации для удаления основной доли экстракта и фильтрование - для извлечения его остальной части.

Использование на последней части очистки активированного угля не является обязательным, однако при его использовании улучшается товарный вид конечного продукта. Вместо активированного угля возможно использование и иных сорбентов, в частности цеолитов или пористого картона.

В результате применения вышеописанного способа получается прозрачный раствор светло-желтого цвета, плотностью 0.95-0.96 г/куб.см, содержащий большое количество БАД, в частности токоферолы, витамин B6, амилолитические и протеолитические ферменты и другие.

В зависимости от используемого растительного сырья и условий проведения процесса состав конечного продукта может существенно варьироваться. Проведенные эксперименты показали, что на базе полученных по данной технологии экстрактов путем их объединения в различных соотношениях может быть получен продукт, обладающий высокими иммуностимулирующими и адаптогенными свойствами и имеющий достаточно стабильный состав.

Полученный в результате реализации указанной технологии продукт, получивший наименование "Настойка зародыша пшеничного "ЭНЗИМВИТ", (т.к. основные элементы технологии его получения отвечают требованиям ГФ XI, в.2, с. 148 "Настойки") представляет собой раствор, содержащий следующие ингредиенты (мас.%):
Этанол - 30-40
Вода - 58-68
Токоферолы - 0.0003 -0.001
Витамин B6 - 0.005-0.01
Иные гидратированные компоненты зародышей пшеницы - Остальное
При меньших концентрациях БАД ухудшается эффективность воздействия "Энзивита" на организм, достигнуть более высоких их концентраций технологически сложно. Использование более разбавленных спиртовых растворов приводит к выделению из раствора маслорастворимых компонентов, использование более концентрированных растворов нетехнологично.

При необходимости в "Энзимвит" могут быть введены различные добавки, улучшающие запах, цвет и иные прикладные характеристики препарата. Результаты практического применения препарата на основе зародышей пшеницы показали, что его введение улучшает адаптацию организма к воздействию внешней среды, усиливает образование антител, уменьшает степень иммунодепрессии. Препарат обладает одновременно антиоксидантными и антигипоксантными свойствами.

Препарат эффективен для лечения таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, нарушения мозгового кровообращения, анемические состояния, вирусные гепатиты, герпес, инфекционно-воспалительные заболевания дыхательных путей и др. Перспективно использование препарата, особенно в форме раствора при физическом и умственном переутомлении, гиповитаминозах, в период реконвалесценции после тяжелых заболеваний. Он оказывает нормализующее влияние на центральную и периферические нервные системы, снимает стрессовые состояния.

Суть и конкретные результаты промышленного применения препарата иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение настойки зародыша пшеничного "ЭНЗИМВИТ".

В круглодонную колбу емкостью 5 л с мешалкой загружают 200 г ЗП и 4.0 л 40% этанола, перемешивают при комнатной температуре 20-30 мин, после чего отстаивают в течение 30-40 мин. Получившийся мутноватый слой декантируют. Дополнительно 80 г ЗП помещают на воронку Бюхнера, пропускают через нее при пониженном давлении 300 мл 40% водного раствора этанола, после чего сливают на нее суспензию ЗП, оставшуюся после декантации, и фильтруют. 865 мл фильтрата присоединяют к декантату и полученную смесь нагревают при 60-70^oC в течение 1 часа, коагулируя белки и пектины, после чего охлаждают до комнатной температуры и отстаивают в течение 16 ч. Верхний слой фильтруют на воронке Бюхнера через активированный уголь. Нижний слой отделяют и дополнительно отстаивают 1-2 недели, отбирая сверху прозрачный продукт, подвергая его очистке по той же технологии и присоединяя к верхнему слою. Общий выход целевого продукта 4.55 л. Состав продукта (мас.%): этанол -39.5, вода - 60, токоферолы - 0.0005, витамин B6 - 0,005, неидентифицированные компоненты экстракта - остальное.

Эксперименты по определению ЛД-50 при внутривенном введении препарата указанного состава проводили на беспородных белых крысах и мышах самцах разводки питомника РАН "Рапполово" после двухнедельного карантина. Животные находились в условиях вивария на стандартном рационе питания со свободным доступом к воде. Масса тела крыс колебалась в пределах от 140 до 175 г, мышей - от 17 до 23 г.

Препарат использовали в форме раствора в воде для перорального введения или в физиологическом растворе в случае необходимости внутрибрюшинного введения, т. е. в фармацевтической форме препарата "Энзимвит" (далее - НЗП). Соответственно, контролем служили либо вода, либо физиологический раствор в эквивалентных объемах.

На модели острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) активность препарата испытывали в диапазоне доз от 1 до 200 мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам. Контрольным животным вводили физиологический раствор внутрибрюшинно. Препаратом сравнения служила официальная настойка корня женьшеня (НКЖ). Оценивали продолжительность жизни на критической высоте и количество выживших животных. Для создания ОГБГ использовали барокамеру с приточно-вытяжной вентиляцией. Животных помещали в барокамеру через 30 мин после внутрибрюшинного введения исследуемого препарата. "Подъем" осуществляли со скоростью 50 м/с на предельную высоту 11000 м над уровнем моря. Отмечали, на какой высоте появляются у мышей плавательные движения, тремор, тризм, нарушения дыхания. Учитывали время жизни животных в ходе эксперимента, рассчитывая процент выживших и погибших на критической высоте. Выжившими считали мышей, выдержавших пребывание на предельной высоте в течение 20 мин. Результаты экспериментов представлены в табл. 1
На основании данных, представленных в табл. 1, можно утверждать, что НЗП обладает антигипоксическим эффектом.

Аналогичные данные были получены при однократном и курсовом пероральном введении НЗП крысам. Так, при однократном введении препарата в дозе 200 мг/кг за 1 ч до "подъема" животных на "высоту" 12000 м продолжительность жизни крыс увеличивалась на 635% по сравнению с контрольной, а выживаемость составляла 40%. Профилактическое введение НЗП в течение 7 дней увеличивало продолжительность жизни животных на 712%, при этом выживаемость сохранялась на уровне 40%.

Влияние НЗП на устойчивость мышей к комплексу экстремальных воздействий изучали на модели ОГБГ + перегревание при 40^oC. Регистрировали продолжительность жизни и выживаемость мышей, помещенных в равномерно подогреваемую барокамеру, "поднимая" их на предельно допустимую "высоту".

Результаты эксперимента по изучению влияния однократного внутрибрюшинного введения НЗП на эти показатели представлены в табл. 2
Полученные результаты свидетельствуют о том, что НЗП существенно влияет на переносимость комплекса экстремальных воздействий.

Оценка адаптогенных свойств препарата была исследована на модели истощающих физических нагрузок в осложненных условиях эмоционального стресса. Опыты проводили на крысах самцах, которых "вынуждали" плавать без предварительной адаптации. Использовали специально изготовленные емкости, в которых поддерживали в течение всего опыта постоянную температуру 28,0±0,5^oC. Воду предварительно загрязняли испражнениями животных для увеличения смачиваемости шерсти и предупреждения пассивного плавания без мышечных усилий. Каждое животное плавало в отдельном цилиндре глубиной 80 см и диаметром 20 см. Одновременно опыт проводили с 8 животными, половину из которых составляли крысы из контрольной группы. Для отягощения использовали груз, составляющий 7% от массы тела, который закрепляли специальным образом у корня хвоста животного. Опыт проводили до изнеможения животных. За отказ от плавания принимали пребывание крысы под водой без попытки выплыть в течение 60 с.

НЗП вводили перорально однократно и в течение 7 дней до постановки эксперимента в дозах 100 и 200 мг/кг. Полученные в этом опыте результаты представлены в табл. 3.

Как видно из материалов табл. 3, введение НЗП в дозе 100 мг/кг было столь же эффективно, как и введение НКЖ. Увеличение дозы вдвое при приеме ежедневно, один раз в сутки в течение недели (профилактически) приводило к усилению защитного эффекта.

Пример 2. Влияние состава настойки зародыша пшеницы "ЭНЗИМВИТ" на ее биологические характеристики.

Оценка эффективности воздействия препарата в форме растворов, полученных по технологии примера 1 и содержащих различные количества ингредиентов, была проведена на группе из 10 добровольцев по методу Фолля (А.В. Салохин и др. Электропунктурная диагностика по методу Фолля. ИМЕРЕС, М., 1993) при приеме однократно дозы в 20 мл препарата.

Использовались препараты следующего состава:
препарат 1 - этанол - 39.5, вода - 60, токоферолы - 0.0005-0.0001, витамин B6 - 0.005, неидентифицированные компоненты экстракта - остальное,
препарат 2 - этанол - 30, вода - 68, токоферолы - 0.0003, витамин B6 - 0.005, неидентифицированные компоненты экстракта - остальное,
препарат 3 - этанол - 40, вода - 58, токоферолы - 0.0008, витамин B6 - 0.01, неидентифицированные компоненты экстракта - остальное,
препарат 4 - этанол - 40, вода - 59, токоферолы - 0.0005, витамин B6 - 0.006, неидентифицированные компоненты экстракта - остальное.

Усредненные полученные результаты для данной группы до и через 30 минут после приема приведены в таблице 4.

Полученные результаты наглядно доказывают эффективность полученных препаратов. Различия в степени их воздействия на организм находятся в пределах погрешности измерения.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Препарат обладает иммуностимулирующим и адаптогенным действием. Содержит водно-спиртовой экстракт зародышей пшеницы при следующем соотношении ингредиентов в конечном продукте, мас. %: этиловый спирт 30 - 40, вода 58 - 68, токоферолы 0,0003 - 0,001, витамин В6 0,005 - 0,01, иные гидратированные компоненты зародышей пшеницы - остальное. Проводят экстракцию зародышей 30 - 50%-ным водным раствором этилового спирта при комнатной температуре в течение по крайней мере 20 мин, после чего отделяют экстракт декантацией и/или фильтрацией. Затем подвергают его нагреванию при 60 - 70^oC в течение по крайней мере 40 мин. Отделяют жидкость и очищают ее фильтрацией через активированный уголь. Изобретение позволяет получить эффективный препарат для нормализации иммунной и сердечно-сосудистой систем. 2 с. и 4 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Препарат, обладающий иммуностимулирующим и адаптогенным действием, содержащий водно-спиртовой экстракт активного начала растительного происхождения, отличающийся тем, что в качестве активного начала он содержит компоненты, содержащиеся в зародышах пшеница при следующем соотношении ингредиентов в конечном продукте, мас.%:
Этиловый спирт - 30 - 40
Вода - 58 - 68
Токоферолы - 0,0003 - 0,001
Витамин B6 - 0,005 - 0,01
Иные гидратированные компоненты зародышей пшеницы - Остальное
2. Способ получения препарата на основе зародышей пшеницы, включающий в себя обработку зародышей растворителем, термическую обработку, выделение активного начала и очистку конечного продукта, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют 30 - 50%-ный водный раствор этилового спирта, обработку проводят при комнатной температуре в течение по крайней мере 20 мин, после чего отделяют экстракт и подвергают его нагреванию при 60 - 70^oC в течение по крайней мере 40 мин. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что отделение экстракта проводят декантацией. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что отделение экстракта проводят фильтрацией. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что отделение экстракта проводят сочетанием декантации и фильтрации. 6. Способ по пп.2 - 5, отличающийся тем, что очистку экстракта проводят фильтрацией его через активированный уголь.