СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/395 A61N2/02 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для стимуляции иммунного ответа у животных.

Наиболее близким к изобретению является стимуляция иммунного ответа у животных путем введения эритроцитов, обработанных in vitro трипсином (Авторское свидетельство N 1037453, A 61 K 39/395 "Способ подготовки эритроцитов для стимуляции животных - продуцентов иммунной сыворотки". Авторы: Л. Г. Прокопенко, А.И.Конопля, Г.Т. Крылова). Сингенные эритроциты, обработанные раствором трипсина в фосфатном буфере, pH 7,6-8,0 в концентрации 6-8•10^-3 мг/мл в течение 2,5-3,5 ч при 36-38^oC и отмытые от трипсина, ресуспендируют в физиологическом растворе хлорида натрия, образуют 5% раствор трипсинизированных эритроцитов, которые и используются для пятикратного внутривенного введения экспериментальным животным перед иммунизацией в дозе 4•10⁸ клеток на 1 кг массы тела с интервалом 24 ч, стимулируют гуморальный иммунный ответ (ГИО). Уровень развития ГИО определяют по титрам антител (Ат) в сыворотке крови реакцией непрямой агглютинации: повышение титра антител на 5-й и 8-й день по сравнению с контролем.

Недостатками описанного способа стимуляции является длительная обработка эритроцитов раствором трипсина in vitro (в течение 2,5-3,5 ч). При этом возможно поступление в организм, наряду с модулированными эритроцитами, чужеродного агента - трипсина, вследствие чего возможно развитие нежелательных побочных эффектов в виде аллергических реакций.

Задачей изобретения является повышение экспрессивности стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных за счет введения цельной массы сингенных или аутологичных эритроцитов, или их тяжелой фракции, подвергнутых воздействию электромагнитных волн миллиметрового диапазона крайне высокой частоты (ЭМ ММВ КВЧ).

Это достигается путем двукратного внутривенного введения экспериментальным животным (крысам линии Вистар) в краевую вену хвоста эритроцитов в виде 5% взвеси в среде 199 в дозе 1 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл, предварительно подвергнутых воздействию КВЧ. Воздействие электромагнитными волнами миллиметрового диапазона крайне высокой частоты проводили с использованием КВЧ-аппарата "Явь-1", при частоте колебаний 42,19 ГГц, длине волны 7,1 мм, при плотности потока энергии излучения не более 10 мВт/см². Время воздействия составляло 1, 2, 5 и 10 мин. Доза микроволнового излучения составляла 2,4-6,0 Дж/см².

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Эритроциты интактных крыс подвергали воздействию ЭМ ММВ КВЧ в течение 1, 2, 5 или 10 мин. С этой целью 15 мл 15% взвеси помещали в кюветы, а сверху располагали излучатель, максимально приближая его к поверхности эритроцитарной взвеси. Облученные эритроциты в виде 5% взвеси в среде 199 в дозе 0,5 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл, вводили внутривенно в краевую вену хвоста интактным реципиентам двукратно с интервалом 24 ч. В последний день введения эритроцитов животных иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ), которые вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 2•10⁸ клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней крыс умерщвляли и определяли в селезенке количество антителообразующих (АОК) и розеткообразующих (РОК) клеток в селезенке животных. О степени стимуляции иммунного ответа судили по показателям АОК и РОК в группе контрольных животных, которым вводили только ЭБ.

Однократное введение эритроцитов, подвергнутых воздействию ЭМ ММВ КВЧ в течение 10 мин, стимулирует формирование гуморального иммунного ответа (ГИО) на ЭБ. Количество АОК и РОК в селезенке опытных животных было соответственно в 1,6 и 2,9 раза выше по сравнению с контрольными животными (введение эритроцитов интактных крыс) (табл. 1).

Результаты проведенных экспериментов показывают, что эритроциты животных, подвергнутые воздействию ЭМ ММВ КВЧ in vitro, приобретают способность стимулировать ГИО на ЭБ при их введении здоровым аллогенным реципиентам.

Пример 2. Развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) отличается по свойствам основных видов клеток и выделяемым факторам (Медуницын Н. В. Повышенная чувствительность замедленного типа // М.: Медицина, 1983. - 160 с.). ГЗТ вызывали двукратным введением ЭБ-сенсибилизирующей дозы внутрибрюшинно (10⁶ клеток в 0,15 М NaCl); разрешающей дозы через 4 дня в подушечку стопы правой лапки (10⁶ клеток в 0,15 М NaCl), а в подушечку левой лапки - раствор 0,15 М NaCl (контроль). Об интенсивности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества карноцитов в них спустя 24 ч после введения разрешающей дозы (Черноусов А. Д., Фонталин Л.Н., Кондратьев Т.К. Формирование гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана при раздельном и сочетанном введении антигена и циклофосфамида // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -1979. -N 5. -С. 449-452).

У крыс при двукратном, с интервалом 24 ч, введении эритроцитов, подвергнутых воздействию ЭМ ММВ КВЧ в течение 10 мин, показатели ГЗТ были выше, чем у интактных животных (см. чертеж).

Результаты проведенных экспериментов показывают, что эритроциты животных, подвергнутые воздействию ЭМ ММВ КВЧ in vitro, приобретают способность стимулировать ГЗТ при их введении здоровым аллогенным реципиентам.

Пример 3. С целью более направленного и эффективного воздействия на организм животных, исследовали иммуномодулирующую способность различных фракций эритроцитов, подвергнутых воздействию ЭМ ММВ КВЧ. Для этого перед облучением эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина. Получали 3 фракции: легкие ("молодые") эритроциты с плотностью меньше 1,079 г/см³, промежуточные, имеющие плотность 1,091-1,105 г/см³ и тяжелые ("старые") эритроциты плотностью 1,117 г/см³.

15 мл 5% взвеси эритроцитов в среде 199 помещали в специальные кварцевые кюветы и подвергали воздействию ЭМ ММВ КВЧ в течение 10 мин. Облученные эритроциты в дозе 0,5 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл, вводили внутривенно в краевую вену хвоста интактным реципиентам двукратно с интервалом 24 ч, с иммунизацией в последний день введения облученных эритроцитов.

Полученные данные показали, что ЭМ ММВ КВЧ индуцирует появление иммуностимулирующих свойств только у тяжелых ("старых") эритроцитов, о чем свидетельствуют высокие показатели АОК и РОК в селезенке опытных крыс и титры Ат сыворотки крови по сравнению с контролем (табл. 2). Промежуточные по плотности эритроциты и их легкая фракция ("молодые") после воздействия физических факторов оставались иммунологически неактивными (табл. 2).

Результаты исследования показывают, что эритроциты, подвергнутые воздействию ЭМ ММВ КВЧ, стимулируют иммунный ответ, быстрее и значительнее (особенно фракция эритроцитов высокой плотности (d>1,117 г/см³) повышают показатели иммунного ответа у здоровых животных.

Пример 4. Одним из наиболее важных свойств иммуностимулятора является возможность проявления иммуностимулирующей активности в условиях вторичного иммунодефицита (Лазарева В. Н. , Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета // М.: Медицина, 1985. -256 с.). Для проверки данного положения об иммуностимуляторах проведена серия экспериментов на крысах Вистар массой 120-180 г; в качестве моделей вторичных иммунодефицитных состояний были использованы следующие: однократное внутрибрюшинное введение циклофосфамида (ЦФ, в дозе 150 мг/кг), инфицирование стафилококком, экспериментальный острый панкреатит (ОП) (Быстрова Н.А. автореф. дис... канд. мед.наук. Киев, 1990, 24 с.).

Результаты опытов показали, что внутрибрюшинное введение живой культуры золотистого стафилококка, циклофосфамида или моделирование экспериментального острого панкреатита угнетает развитие ГИО на ЭБ (см. табл. 3, 4, 5).

Цельные ММВ-эритроциты отменяют возникающую иммунодепрессию, а фракции тяжелых ММВ-эритроцитов не только отменяют иммуносупрессию в условиях ОП, стафилококковой инфекции и при введении циклофосфамида, но и оказывают иммуностимулирующее действие, что подтверждает эффективность предлагаемого способа иммуностимуляции не только на здоровых животных, но и в условиях вторичного иммунодефицита.

Таким образом, результаты исследований доказывают, что предлагаемый способ эффективно стимулирует иммунный ответ, не требует длительной обработки эритроцитов, исключает поступление в организм нежелательных химических агентов (трипсин), быстрее и в большей степени (особенно тяжелая фракция эритроцитов) повышает показатели иммунного ответа у здоровых крыс, а также эффективен в условиях вторичного иммунодефицита.

Описание к чертежу. Влияние электромагнитных волн миллиметрового диапазона крайне высокой частоты на развитие реакции ГЗТ, индуцированной ЭБ.

По оси ординат: I - разница массы (мг) регионарного и контрлатерального лимфатических лимфоузлов;
II - разница количества кариоцитов (млн.) в этих лимфатических узлах;
По оси абсцисс: 1 - введение эритроцитов барана интактным реципиентам;
2 - фиксация; 3 - введение ММВ-эритроцитов, облученных в течение 1 мин; 4 - введение ММВ-эритроцитов, облученных в течение 2 мин; 5 - введение ММВ-эритроцитов, облученных в течение 5 мин; 6 - введение ММВ-эритроцитов, облученных в течение 10 мин.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для стимуляции иммунного ответа у лабораторных животных. Способ обеспечивает повышение экспрессивности стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных за счет введения цельной массы сингенных, или аутологических эритроцитов, или их тяжелой фракции, подвергнутых воздействию электромагнитных волн миллиметрового диапазона крайне высокой частоты. Способ осуществляется следующим образом: экспериментальным животным перед иммунизацией двукратно внутривенно в краевую вену хвоста вводят эритроциты в виде 5% взвеси в среде 199 в дозе 1 мл, содержащей 8 х 10⁸ клеток/мл, предварительно подвергнутых воздействию электромагнитного излучения миллиметрового диапазона, которое проводили с использованием КВЧ-аппарата "Явь-1", при частоте колебаний 42,19 ГГц, длине волны 7,1 мм, при плотности потока мощности излучения не более 10 мВт/см². Время воздействия составляла 1, 2, 5 и 10 мин. Доза микроволнового излучения составляла 2,4 - 6,0 Дж/см. 5 табл., 1 ил.

Способ стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных, включающий забор крови, выделение эритроцитов с последующей их обработкой, отличающийся тем, что цельную массу сингенных аутологических эритроцитов и их тяжелую фракцию подвергают воздействию электромагнитных волн миллиметрового диапазона крайне высокой частоты в течение 10 мин.