СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для стимуляции иммунного ответа у животных.

Наиболее близким к изобретению является стимуляция иммунного ответа у животных путем введения эритроцитов, обработанных in vitro лизоцимом (Прокопенко Л. Г. Сипливая Л.Е. и др. Авт. свид. СССР N1568076, кл. G09B 23/28, 1990).

Сингенные эритроциты, обработанные 0,5%-ным раствором яичного лизоцима и введенные экспериментальным животным перед иммунизацией, двукратно, с интервалом 24 ч, внутрибрюшинно в дозе 2•10⁸ клеток на 100 г массы тела, стимулируют гуморальный иммунный ответ (ГИО): увеличение количества антителообразующих клеток (АОК) и розеткообразующих клеток (РОК) по сравнению с контрольной группой.

Описанный способ стимуляции требует длительной обработки эритроцитов раствором лизоцима in vitro (в течение 3 4 ч). При этом возможно поступление в организм наряду с модулированными эритроцитами чужеродного белка - лизоцизма, что может вызывать нежелательные побочные эффекты в виде аллергических реакций.

Задачей изобретения является повышение эффективности стимуляции иммунного ответа у животных за счет введения цельной массы сингенных или аутологичных эритроцитов или их тяжелой фракции, подвергнутых воздействию магнитно-лазерного облучения (МЛО).

Поставленная задача достигается путем введения экспериментальным животным (крысам Вистар) перед иммунизацией двукратно внутривенно в краевую вену хвоста эритроцитов в виде 5%-ной взвеси в среде 199 в дозе 1 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл, предварительно подвергнутых воздействию МЛО, которое проводили с использованием лазерного аппарата "Узор" Калужского радиолампового завода, инфракрасного диапазона с длиной волны 0,89 мкм, с импульсным режимом излучения с частотой 150 Гц. Средняя выходная мощность излучения не более 2 Вт. Постоянное магнитное поле использовали одновременно с лазерным излучением, магнитная насадка крепилась к излучателю и имела напряженность магнитного поля порядка 25 35 мТл.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Эритроциты интактных крыс подвергали воздействию МЛО в течение 30, 60 или 120 с. С этой целью 15 мл 5%-ной взвеси помещали в кварцевые кюветы, а сверху помещали излучатель с магнитной насадкой, максимально приближая его к поверхности эритроцитарной взвеси. Облученные эритроциты в виде 5% -ной взвеси в среде 199 в дозе 0,5 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл, вводили внутривенно с интервалом 24 ч. В последний день введения облученных эритроцитов животных иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ), которые вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 2•10⁸ клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней крыс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК. О степени стимуляции иммунного ответа судили по определяемым показателям при сравнении с показателями в группе животных, получивших только ЭБ.

Двукратное введение эритроцитов с интервалом 24 ч, подвергнутых воздействию МЛО в течение 120 с, стимулирует формирование ГИО на ЭБ. Количество АОК и РОК в селезенке опытных животных было в 1,8 и 2,1 раза выше, чем в контрольной группе (введение эритроцитов интактных крыс) (см.табл.1).

Результаты проведенных экспериментов показывают, что эритроциты животных, подвергнутые воздействию МЛО in vitro, приобретают способность стимулировать гуморальный иммунный ответ на ЭБ при их введении здоровым аллогенным реципиентам.

Пример 2. Развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) отличается от ГИО по свойствам основных видов клеток и выделяемых ими факторов (Медуницин Н.В. 1983). ГЗТ вызывали двукратным введением ЭБ - сенсибилизирующей дозы внутрибрюшинно (10⁸ клеток в 0,15 M NaCl); разрешающей дозы через 4 дня в подушечку стопы правой лапки (10⁶ клеток в 0,15 M NaCl), а в подушечку левой лапки раствор 0,15 M NaCl (контроль). Об интенсивности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества кариоцитов в них спустя 24 ч после введения разрешающей дозы (Черноусов А.Д. Фонталин Л.Н. и др. 1979).

У крыс при двукратном введении эритроцитов с интервалом 24 ч, подвергнутых воздействию МЛО в течение 120 с, показатели ГЗТ оказались выше, чем у интактных животных (см. фиг.1).

Описание к фиг.1. Влияние МЛО-эритроцитов на развитие реакции ГЗТ, индуцированной ЭБ.

По оси ординат: I разница масс (мг) регионарного и контрлатерального лимфатических узлов;
II разница количества кариоцитов (млн) в этих лимфатических узлах.

По оси абсцисс: 1 введение ЭБ; 2 однократное введение эритроцитов интактных крыс; 3 двукратное введение эритроцитов интактных крыс; 4 - однократное введение МЛО-эритроцитов (30 с); 5 однократное введение МЛО-эритроцитов (60 с); 6 однократное введение МЛО-эритроцитов (120 с); 7 - двукратное введение МЛО-эритроцитов (30 с); 8 двукратное введение МЛО-эритроцитов (30 с); 9 двукратное введение МЛО-эритроцитов (120 с).

На этом чертеже в каждой группе было по 8 10 крыс;
* значок, обозначающий достоверные различия по отношению к контрольным животным.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что эритроциты животных, подвергнутые воздействию МЛО in vitro, приобретают способность стимулировать ГЗТ при их введении здоровым аллогенным реципиентам.

Пример 3. С целью более направленного и эффективного воздействия на организм животных исследовали иммуномодулирующую способность различных фракций эритроцитов, подвергнутых воздействию МЛО.

Для этого перед облучением эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина. Получали 3 фракции: легкие ("молодые") эритроциты с плотностью, меньшей 1,079, промежуточные, имеющие плотность 1,091 1,105, и тяжелые ("старые") эритроциты, плотность которых превышала 1,117 [4]
15 мл 5%-ной взвеси эритроцитов в среде 199 помещали в кварцевык кюветы и подвергали действию МЛО. Облученные эритроциты в дозе 0,5 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл, вводили внутривенно в краевую вену хвоста интактным реципиентам двукратно с интервалом 24ч, с иммунизацией в последний день введения облученных эритроцитов.

Полученные данные показали, что МЛО индуцирует появление иммуностимулирующих свойств только у тяжелых ("старых") эритроцитов. Так показатели АОК и РОК в селезенке опытных крыс возрастают соответственно в 5,4 и 2,8 раз по сравнению с контролем (см. табл.2). Промежуточные по плотности эритроциты и их легкая фракция ("молодые") после воздействия МЛО оставались иммунологически неактивными.

Результаты исследований показали, что применение указанного способа стимуляции иммунного ответа не требует длительной обработки эритроцитов, исключает поступление в организм нежелательных химических агентов (чужеродного белка лизоцима), быстрее и значительнее (особенно тяжелая фракция эритроцитов) повышает показатели иммунного ответа у здоровых крыс.

Способ может быть использован в эксперименте и в ветеринарии для стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа у животных.

Использование: медицина и биология. Сущность изобретения: способ стимуляции иммунологической реактивности заключается во введении сингенных эритроцитов. Эритроциты перед введением подвергали магнито-лазерному облучению in vitro в течение 30, 60 или 120 с. Лазерное излучение инфракрасного диапазона с длиной волны λ -0,89 мкм, частота - 150 Гц, напряженность постоянного магнитного поля используемой магнитной насадки - 35 мТл. 1 ил., 2 табл.

Способ стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных, включающий введение им сингенных эритроцитов, отличающийся тем, что эритроциты перед введением подвергают магнитно-лазерному облучению с длиной волны 0,89 мкм, частотой 150 Гц, напряженностью постоянного магнитного поля используемой магнитной насадки 35 мТл in vitro в течение 30, 60 или 120 с.