СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 A61K39/395 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для стимуляции иммунного ответа у животных.

Наиболее близким к изобретению является стимуляция иммунного ответа у животных путем введения эритроцитов, подвергнутых воздействию высокой внешней температуры. (Яхонтов Ю.О., Прокопенко Л.Г. Изучение иммуногенных и адъювантных свойств эритроцитов крыс, подвергнутых воздействию высокой внешней температуры, МЭИ, N 7, 1979, с.108-111).

Задачей изобретения являются повышение экспрессивности стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных за счет введения целевой массы сингенных или аутологичных эритроцитов, или их тяжелой фракции, подвергнутых воздействию ультразвука (УЗ).

Это достигается путем введения экспериментальным животным (крысам Вистар) перед иммунизацией двукратно внутривенно в краевую вену хвоста эритроцитов в виде 5%-ной взвеси в среде 199 в дозе 1 мл, содержащей 8 • 10⁸ клеток/мл, предварительно подвергнутых воздействию УЗ, которое проводили с использованием ультразвукового аппарата (УЗТ-1.01) при частоте 0,88 мГц, при плотности потока мощности (ППМ) 0,4 Вт/см², непрерывном режиме. Использовался вибратор с рабочей поверхностью 4 см².

На чертеже изображен график подготовки эритроцитов для стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных.

Пример 1. Эритроциты интактных крыс подвергли воздействию УЗ в течение 30, 60 или 120 с. С этой целью 15 мг 5%-ной взвеси помещали в кюветы, а сверху располагали излучатель, максимально приближали его к поверхности эритроцитарной взвеси. Озвученные эритроциты в виде 5%-ной взвеси в среде 199 в дозе 0,5 мл, содержащей 8 • 10⁸ клеток/мл, вводили внутривенно в краевую вену хвоста интактных реципиентам двукратно с интервалом 24 ч. В последний день введения эритроцитов животных иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ), которые вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 2 • 10⁸ клеток на 100 г массы тела. Через 5 дн крыс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК. О степени стимуляции иммунного ответа судили по определенным показателям в группе контрольных животных, получавших только ЭБ.

Двукратное введение эритроцитов с интервалом 24 ч, подвергнутых воздействию УЗ в течение 120 с, стимулирует формирование ГИО на ЭБ. Количество АОК и РОК в селезенке опытных животных было 1,8 и 2,1 раза выше, чем в контрольной группе (введение эритроцитов интактных крыс) (см. табл. 1).

Результаты проводимых экспериментов показывают, что эритроциты животных, подвергнутые воздействию УЗ in vitro, приобретают способность стимулировать ГИО на ЭБ при их введении здоровым аллогенным реципиентам.

Пример 2. Развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) отличается от ГИО по свойствам основных видов клеток и выделяемым фактором (Медуницин Н. В. , Повышенная чувствительность замедленного типа, М.: Медицина, 1983, 160 с.). ГЗТ вызывали двукратным введением ЭБ-сенсибилизирующей дозы внутрибрюшинно (10⁶ клеток в 0,15 M NaCl); разрешающей дозы через 4 дн в подушечку стопы правой лапки (10⁶ клеток в 0,15 M NaCl), а в подушечку левой лапки раствор 0,15 M NaCl (контроль). Об интенсивности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества кариоцитов в них спустя 24 ч после введения разрешающей дозы (Черноусов А. Д. , Фонталин Л.Н., Кондратьев Т.К., Формирование гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана при раздельном и сочетанном введении антигена и циклофосфамида. //Бюлл. эксперим. биологии и медицины, - 1979, - N 5, - с.449-452).

У крыс при двукратном введении эритроцитов с интервалом в 24 ч, подвергнутых воздействию УЗ в течение 120 с, показали ГЗТ оказалось выше, чем у интактных животных (см. чертеж).

Результаты, проводимых экспериментов показывают, что эритроциты животных, подвергнутые воздействию УЗ in vitro, приобретают способность стимулировать ГЗТ при их введении здоровым аллогенным реципиентам.

Пример 3. С целью более направленного и эффективного воздействия на организм животных исследовали иммуномодулирующую способность различных фракций эритроцитов, подвергнутых воздействию УЗ. Для этого перед облучением эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина. Получили 3-и фракции: легкие (молодые) эритроциты с плотностью меньше 1,079, промежуточные, имеющие плотностью 1,091 - 1,105 и тяжелый (старый) эритроциты, плотностью 1,117 г/см².

15 мл 5%-ной Взвеси эритроцитов в среде 199 помещали в кюветы и подвергали действию УЗ. Озвученные эритроциты в дозе 0,5 мл, содержащей 8 • 10⁸ клеток/мл, вводили внутривенно в краевую вену хвоста интактным реципиентам двукратно с интервалом 24 ч с иммунизацией в последний день введения озвученных эритроцитов.

Полученные данные показали, что УЗ индуцирует появление иммуностимулирующих свойств только у тяжелых (старых) эритроцитов. Так показывали АОК и РОК в селезенке опытных крыс возрастают соответственно в 5,4 и 2,8 раз по сравнению с контролем (см. табл. 2).

Промежуточные по плотности эритроциты и их легкая фракция (молодые) после воздействия УЗ оставались иммунологически неактивными.

Пример 4. Одним из наиболее важных свойств иммуностимулятора является возможность проявления соответствующей активности в условиях вторичного иммунодефицита (Лазарева В.Н., Алехин Е.К., Стимуляторы иммунитета, М.: Медицина, 1985, 256 с).

Для проверки данного положения проведена серия экспериментов на мышах линии СВА, где в качестве моделей вторичного иммунодефицитного состояния было использовано однократное внутрибрюшинное введение циклофосфамида (150 мг/кг) или митогена Кон-А (25 мкг/мышь) (Новиков В.И., Власов А.А., Сидонекин И.Г., Влияние прилипающих клеток периферической крови и лимфатических узлов на процессы антителогенеза в продуктивную фазу иммунного ответа. Иммунология, 1992, N 2, с. 18-20).

Результаты опытов показали, что при введении циклофосфамида или Кон-А угнетают развитие ГИО на ЭБ (см. табл. 3 и 4).

Цельные УЗ-эритроциты отменяют возникающую иммуносупрессию, а фракции тяжелых УЗ-эритроцитов не только имеют иммуносупрессирующее влияние циклофосфамида и Кон-А, но и оказывают иммуностимулирующее действие, что указывает на эффективность предлагаемого способа иммуностимуляции не только на здоровых животных, но и в условиях вторичного иммунодефицита.

Результаты исследований доказывают, что предлагаемый способ эффективно стимулируют иммунный ответ, не требует длительной обработки эритроцитов, исключает поступление в организм нежелательных химических агентов (трипсин), быстрее и значительнее (особенно тяжелая фракция эритроцитов) повышает показатели иммунного ответа у здоровых крыс, а также эффективен в условиях вторичного иммунодефицита.

Способ может быть использован в экспериментальной медицине и в ветеринарии для стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа у животных.

Описание к чертежу. Влияние УЗ-эритроцитов на развитие реакции ГЗТ, индуцированной ЭБ.

По оси ординат: I - разница массы (мг) регионарного и контрлатерального лимфатических узлов; II - разница количества (млн) в этих лимфатических узлах.

По оси абсцисс: 1 - введение ЭБ; 2 - однократное введение эритроцитов интактных крыс; 3 - двукратное введение эритроцитов интактных крыс; 4 - однократное введение УЗ-эритроцитов (30 с); 5 - однократное введение УЗ-эритроцитов (60 с); 6 - однократное введение УЗ-эритроцитов (120 с); 7 - двукратное введение УЗ-эритроцитов (30 с); 8 - двукратное введение УЗ-эритроцитов (60 с); 9 - двукратное введение УЗ-эритроцитов (120 с).

На этой фигуре в каждой группе было по 8 - 10 крыс;
* - значок, обозначающий достоверные различия по отношению к контрольным животным.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для стимуляции иммунного ответа у лабораторных животных. Экспериментальным животным перед иммунизацией двукратно внутривенно в краевую вену хвоста вводят эритроциты в виде 5%-ный взвеси в среде 199 в дозе 1 мл, содержащей 8•10⁸ клеток/мл. Взвесь эритроцитов предварительно подвергают воздействию ультразвука. Воздействие проводят с использованием ультразвукового аппарата (УЗТ-1.01) при частоте 0,88 мГц, при плотности потока мощности 0,4 Вт/см², непрерывном режиме. Используют вибратор с рабочей поверхностью 4 см². Предлагаемый способ эффективно стимулирует иммунный ответ. Он не требует длительной обработки эритроцитов, исключает поступление в организм нежелательных химических агентов. Способ также эффективен в условиях вторичного иммунодефицита. 1 ил., 4 табл.

Способ стимуляции иммунологической реактивности у лабораторных животных, включающий забор крови, выделение эритроцитов с последующей их обработкой, отличающийся тем, что цельную массу сингенных и аутологичных эритроцитов и их тяжелую фракцию подвергают ультразвуковому воздействию in vitro в течение 30 - 120 с.