БЕТА-ГИДРОКСИНИКОТИНОИЛГИДРАЗОН 2-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИ-4-ФОРМИЛ-5-ОКСИМЕТИЛПИРИДИНА ДИГИДРОХЛОРИД, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АНТИОКСИДАНТНУЮ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНУЮ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2007 года по МПК C07D401/12 

Изобретение относится к синтезу новых биологически активных химических соединений, конкретно к β-гидроксиникотиноилгидразону 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорида общей формулы I:

который обладает антиоксидантным, гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием и может найти применение в медицине.

Прототипом по действию и соединением родственным по химической структуре, является широко применяемый в медицине антиоксидант - мексидол.

Задачей изобретения является создание более эффективного антиоксиданта, проявляющего дополнительно иммуномодулирующую и гепатопротекторную активность.

Поставленная задача достигается новой химической структурой формулы I, получаемой при взаимодействии гидразида 5-гидроксиникотиновой кислоты с 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридином гидрохлоридом в присутствии растворителя и соляной кислоты при нагревании. Выход целевого продукта составил 93,3% от теоретического. Соединение I - светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, мало растворимое в ДМСО и других органических растворителях.

Т. пл. (с разложением) 216-217°С. Найдено, %: С 45,00; Н 4,26; N 14,65; Cl 18,75: C₁₄H₁₆N₄O₄Cl₂. Вычислено, %: С 44,80; Н 4,26; N 14,91; Cl 18,92; ИК-спектр, см^-1: 3370, 3310, 1680, 1610, 1550, 1310, 1150, 1050, 830. УФ-спектр, нм: 300,338 (в этаноле). Пример. β-Гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид (I).

К раствору 3,06 г (0,02 моль) гидразида 5-гидроксиникотиновой кислоты в 450 мл воды при 35-40°С добавляют 3,3 мл соляной кислоты, раствор 4,07 г (0,02 моль) 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина гидрохлорида в 19 мл воды и перемешивают при 55-60°С в течение 1 часа. Реакционную массу упаривают в вакууме при 75-80°С и Р_ост.=20 мм рт.ст., досушивают при 100°С, получают 7,0 г соединения I (93,3%).

Острую токсичность исследуемого соединения I и препарата сравнения - мексидола изучали в опытах на мышах массой 18-22 г с определением ЛД₅₀ по методу Литчфилда и Уилкоксона. Соединения вводили внутрибрюшинно. ЛД₅₀ соединения I составляет 700 мг/кг, мексидола - 800 мг/кг.

Было изучено влияние соединения I и мексидола на антиоксидантную, гепатопротекторную и иммунологическую реактивность крыс, индуцированную эритроцитами барана (ЭБ), в норме, а также в условиях повышенной и пониженной иммунной реактивности. Проведены следующие серии экспериментов:

1 серия экспериментов - на здоровых животных;

2 серия экспериментов - в условиях острого токсического поражения печени;

3 серия экспериментов - в условиях экспериментального острого панкреатита.

Исследования проведены на крысах Вистар массой 120-180 г. В первой серии экспериментов соединение I и мексидол вводили пятикратно (интервал 24 ч), внутрибрюшинно. Развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) индуцировали внутрибрюшинным введением ЭБ (однократно в дозе 10⁸ кл/кг). Для оценки выраженности ГИО в селезенке определяли количество антителообразующих клеток (АОК) (Мальберг К., Зигль Э., 1987) и число иммунных розеткообразующих клеток (РОК) (Зауэр X., 1987) через 5 суток после внутрибрюшинной иммунизации (2×10⁹ ЭБ). При оценке выраженности ГЗТ, через 4 суток после внутрибрюшинной сенсибилизации ЭБ (10 клеток), в подушечку задней конечности вводили разрешающую дозу антигена (10⁶ ЭБ). Спустя 24 ч определяли разницу массы (РМЛ) и количества кариоцитов (РКЛ) в регионарном и контралатеральном лимфатических узлах (Федосеева В.Н. и соавт., 1993).

Во второй серии экспериментов воспроизводили модель острого токсического гепатита путем внутримышечного введения 50% раствора четыреххлористого углерода (CCl₄) на оливковом масле (3 мл/кг) и внутрибрюшинного введения соединения I и мексидола в течение 5 дней с интервалом 24 ч. Развитие ГИО и ГЗТ индуцировали так же, как и в первой серии экспериментов.

В третьей серии экспериментов моделировали острый панкреатит по Шалимову С.А. и соавт. (1989) в модификации Чуевой Т.В.(2002). Экспериментальным крысам проводили лапаротомию, затем при помощи жидкого азота производили криогенное воздействие на головку поджелудочной железы, через 3 часа развивался острый отечный панкреатит, подтвержденный морфологически. Соединение I и мексидол вводили внутрибрюшинно в течение 7 дней после операции с интервалом 24 ч. Экспериментально установлено, что максимальная иммуносупрессия при моделировании острого панкреатита отмечается на 5-7 сутки. В связи с этим исследование количества АОК, РОК и показателей ГЗТ проводили на 7 сутки после лапаротомии по той же схеме, что и в первой серии экспериментов.

Соединение I и мексидол вводили во всех исследованиях в экспериментально подобранных дозах 35 мг/кг и 30 мг/кг соответственно. Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом.

Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сыворотке крови ацилгидроперекисей (В.И.Бенисевич, Л.И.Идельсон, 1973) и малонового диальдегида (Н.Д.Стальная, Т.Г.Гаришвилли, 1977). Антиоксидантный статус оценивали по методике вычисления каталазного числа. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами. Математический анализ полученных данных проводили с помощью программы «Statistica 6.0 StatSoft, USA».

Установлено, что пятикратное внутрибрюшинное введение соединения I вызывает достоверное иммуностимулирующее действие, увеличивает количество АОК в 2,1 раза и РОК в 1,9 раза по сравнению с контролем. Внутрибрюшинное введение мексидола не оказывает влияния на иммунный ответ животных (табл.1).

Таблица 1
Острая токсичность и влияние соединения I и мексидола на формирование ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ№ гр.Условия опытаЛД₅₀, мг/кгАОК, тыс./органРОК, млн./органРМЛ,
мгРКЛ,
×10⁶1Иммунизация ЭБ-21,2±3,1^*495,5±6,5^*41,8±0,2^*3,41,3±0,1^*3,42Введение физиологического раствора-22,9±2,3^*491,0±6,1^*41,7±0,2^*3,41,2±0,1^*3,43Введение мексидола80021,9±3,2^*4108,3±9,9^*44,6±0,4*^1,23,1±0,3*^1,24Введение соединения I70046,8±3,5* ^1,2,3170,4±10,1*^1,2,34,5±0,4*^1,23,3±0,3*^1,2Примечание: здесь и в последующих таблицах: * - р<0,05, цифра рядом со звездочкой указывает, по отношению к показателю какой группы различия достоверны.

Как следует из данных, приведенных в табл.1, соединение I стимулирует развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа на эритроциты барана. Разница масс регионального и контралатерального лимфатических узлов (РМЛ) и количество в них ядросодержащих клеток (РКЛ) при введении соединения I увеличиваются в 2,7 раза. Препарат сравнения - мексидол обладает аналогичной активностью.

При исследовании биохимических показателей сыворотки крови здоровых животных, характеризующих антиоксидантную активность, установлено, что введение соединения I и мексидола не влияет на данные показатели и, следовательно, на процессы ПОЛ (табл.2).

Таблица 2
Влияние соединения I и мексидола на процессы перекисного окисления липидов у крыс№
гр.Условия опытаАГП,
усл.ед.МДА,
мкмоль/лКаталазное число1Интактные крысы2,3±0,124,5±4,325,3±3,32Введение физиологического раствора2,2±0,128,4±4,628,3±4,03Введение мексидола2,2±0,227,8±5,320,4±3,14Введение соединения I2,1±0,125,1±4,224,6±4,0

Во второй серии экспериментов была изучена иммуномодулирующая активность соединения I и мексидола в условиях повышенной иммунной реактивности. В качестве экспериментальной модели патологии была использована модель токсического поражения печени, которая моделировалась путем внутримышечного введения четыреххлористого углерода (CCl₄) (табл.3).

Таблица 3
Влияние соединения I и мексидола на формирование ГИО и ГЗТ в условиях острого токсического поражения печени№
гр.Условия опытаАОК,
тыс./органРОК,
млн./органРМЛ,
МгРКЛ,
×10⁶1Иммунизация ЭБ18,5±2,0^*3,496,5±6,5^*3,41,8±0,1^*3,41,4±0,2^*3,42Введение оливкового масла22,3±2,5^*3107,3±5,1^*3,41,9±0,2^*3,41,4±0,2^*3,43Введение CCl₄58,4±4,6*^1,2,4,5174,3±8,8*^1,2,4,55,5±0,2^*1.2,4,55,4±0,2^*1,2,4,54Введение CCl₄ и мексидола30,4±3,1*^1,3135,9±7,2*^1-3,53,0±0,2^*1-3,52,3±0,2^*1-35Введение CCl₄ и соединения I24,1±2,3*³110,б±7,1*^3,42,1±0,2^*3,42,0±0,3^*3

Установлено, что внутримышечное введение крысам в течение 5 дней оливкового масла не влияет на формирование ГИО, индуцированного ЭБ. Введение CCl₄ повышает иммунологическую реактивность на ЭБ, что проявляется увеличением в селезенке отравленных крыс числа иммунных АОК в 3,2 раза, РОК в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой животных (табл.3).

При внутрибрюшинном введении соединения I, в течение 5 суток в дозе 35 мг/кг, показатели количества АОК и РОК оставались на уровне контрольных данных, несмотря на введение CCl₄. Иммуномодулирующая активность соединения I превосходит таковую у мексидола.

Исследование развития ГЗТ выявило аналогичную с ГИО динамику изменения показателей. Установлено, что максимальным корригирующим влиянием на показатели РМЛ и РКЛ, при токсическом поражении печени, обладает соединение I. Внутрибрюшинное введение соединения I в дозе 35 мг/кг оказывает выраженное гепатопротекторное действие, в серии экспериментов с данным соединением не наблюдалось достоверного увеличения показателей РМЛ и РКЛ по сравнению с контрольными данными (табл.3).

Введение CCl₄ статистически достоверно приводит к выраженному повышению содержания продуктов ПОЛ в экспериментальной группе животных. Кроме того, отмечается достоверное, в 2,1 раза, снижение активности каталазы, по сравнению с контрольной группой животных (табл.4). Все это дает возможность говорить об усилении процессов ПОЛ у животных в условиях острой токсической гепатопатии.

Таблица 4
Влияние соединения I и мексидола на процессы перекисного окисления липидов в условиях острого токсического поражения печени№
гр.Условия опытаАГП
усл. ед.МДА
мкмоль/лКаталазное число1.Интактные крысы2,3±0,1^*2,324,5+4,3^*2,325,3±3,3^*2,32.Введение CCl₄4,7+0,2*^1,3,439,6+3,2*^1,412.4+1,7*^1,43.Введение CCl₄ и мексидола3,5±0,1*^1,2,431,6±3,2*^1,2,414,3±1,6*^1,44.Введение CCl₄ и соединения I2,3±0,1*^2,322,9±2,1*^2,323,1±2,3*^2,3

Соединение I проявляет выраженные антиоксидантные и мембранно-стабилизирующие свойства в условиях токсической гепатопатии. Его внутрибрюшинное введение полностью защищает мембраны гепатоцитов от повреждающего действия CCl₄, показатели интенсивности ПОЛ остаются на уровне контрольных данных. Внутрибрюшинное введение мексидола уменьшает выраженность процессов ПОЛ, но уступает по активности соединению I. Так, введение мексидола в дозе 30 мг/кг, уменьшает концентрацию АГП и МДА в 1,3 раза, увеличивает концентрацию каталазы в 1,2 раза по сравнению с данными, полученными у животных с токсической гепатопатией (табл.4).

В третьей серии экспериментов изучалась коррекция нарушений иммунной реактивности соединением I и мексидолом в условиях вторичного иммунодефицита на модели острого отечного панкреатита. Результаты экспериментов по изучению ГИО и ГЗТ на ЭБ при экспериментальном остром отечном панкреатите представлены в табл.5. Выявлено, что на 7-е сутки количество иммунных АОК и РОК в селезенке крыс с острым панкреатитом уменьшилось по сравнению с контролем в 2,6 и 2,3 раза соответственно. Показатели РМЛ и РКЛ уменьшились в 1,7 и 1,9 раза соответственно. Данные показатели в группе животных с ложной лапаротомией не отличаются от контрольных данных.

Таблица 5
Влияние соединения I и мексидола на формирование ГИО и ГЗТ в условиях острого отечного панкреатита№
гр.Условия опытаАОК,
тыс./органРОК,
млн./органРМЛ,
мгРКЛ,
×l0⁶1Иммунизация ЭБ18,5±2,0^*3,496,5±6,5^*3,41,8±0,1^*31,4±0,2^*32Ложная лапаротомия16,5±1,9^*394,7±5,9^*3,41,6±0,2^*31,5±0,2^*33Острый панкреатит7,2±1,1*^1,2,4,542,3±4,6*^1,2,4,51,0±0,1^*1,2,4,50,8±0,2^*1,2,3,44Острый панкреатит и введение мексидола11,8±1,3*^1,372,5±7,1*^1,2,31,3±0,1^*31,4±0,2^*35Острый панкреатит и введение соединения I16,3±2,1*³81,4±7,2*³1,7±0,2^*31,4±0,2^*3

Введение препарата сравнения - мексидола достоверно увеличивает количество антитело - и розеткообразующих клеток. Однако данные показатели не достигают уровня контрольных значений. Введение соединения I, как и в серии экспериментов с моделированием токсического поражения печени, оказывает максимальное воздействие на иммунную реактивность крыс, индуцированную ЭБ, в условиях острого панкреатита. Показатели АОК и РОК в данной серии экспериментов остаются на уровне контрольных данных, т.е. наблюдается иммунокоррегирующий эффект, наиболее выраженный в условиях вторичного иммунодефицита.

Соединение I стимулирует развитие реакции ГЗТ в условиях острого панкреатита. Показатели РМЛ и РКЛ в серии экспериментов с введением данного соединения достигают уровня контрольных значений. Данная тенденция наблюдается и в сериях экспериментов с введением мексидола. Однако показатель РМЛ в экспериментах с применением мексидола не достигает уровня контрольных значений (табл.5).

Экспериментальная модель острого отечного панкреатита характеризуется развитием цитолитического поражения тканей и увеличением концентрации продуктов ПОЛ. Концентрация АГП и МДА возрастает в 3,2 и 2 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой животных. Активность каталазы снижается с 25,3±3,9 в контроле, до 8,4±1,1 в группе животных с острым панкреатитом (табл.6).

Таблица 6
Влияние соединения I и мексидола на процессы перекисного окисления липидов в условиях острого отечного панкреатита.№
гр.Условия опытаАГП
усл.едМДА
мкмоль/лКаталазное Число1.Интактные крысы2,3±0,1^*3-524,5+4,3^*325,3+3,3^*3,42.Ложная лапаротомия2,2±0,1^*3-527,1±2,4^*323,5±2,1^*3,43.Острый панкреатит7,4±0,3*^1,2,4,549,1±4,1*^1.2,4,58,3±1,1*^1,2,4,54.Острый панкреатит и введение мексидола4,8±0,3*^1-3,532,0±4,3*³14,6±1,9*^1-3,55.Острый панкреатит и введение соединения I3,9±0,3*^1-425,4±1,3*^3,5-720,1±2,0*^3,4

Следует отметить, что в группе «ложнооперированных» животных не наблюдается отклонения показателей уровня продуктов ПОЛ и активности каталазы от контрольных данных. Введение соединения I в условиях острого отечного панкреатита сохраняет исследуемые показатели на уровне контрольных данных. По антиоксидантному и мембранопротекторному действию данное соединение превосходит мексидол (табл.6).

Таким образом, заявляемое соединение I в дозе 35 мг/кг вызывает выраженную стимуляцию гуморального иммунного ответа у крыс. Мексидол в дозе 30 мг/кг данной активностью не обладает.

Соединение I и мексидол не влияют на процессы перекисного окисления липидов в физиологических условиях.

По влиянию на реакцию гиперчувствительности замедленного типа соединение I проявляет равную с мексидолом активность.

Соединение I отменяет иммуносупрессирующий эффект, возникающий при экспериментальном остром панкреатите, и иммуностимуляцию, индуцированную введением CCl₄, и на данных моделях превосходит по иммуномодулирующему, антиоксидантному и гепатопротекторному действию препарат сравнения - мексидол.

Данное соединение может быть использовано при создании препаратов с антиоксидантным, иммуномодулирующим и гепатопротекторным действием.

Изобретение относится к области новых биологически активных химических соединений, а именно к β-гидроксиникотиноилгидразону 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилперидина дигидрохлорида общей формулы I, который обладает антиоксидантным, гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием. Соединение формулы I получают взаимодействием гидразида 5-гидроксиникотиновой кислоты с 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридином гидрохлоридом в присутствии растворителя и соляной кислоты при нагревании. Соединение формулы I вызывает выраженную стимуляцию гуморального иммунного ответа у крыс. Известный антиоксидант - мексидол данной активностью не обладает. По влиянию на реакцию гиперчувствительности замедленного типа соединение I проявляет равную с мексидолом активность. Соединение формулы I отменяет иммуносупрессирующий эффект, возникающий при экспериментальном остром панкреатите, и иммуностимуляцию, индуцированную введением CCl₄, и на данных моделях превосходит по иммуномодулирующему, антиоксидантному и гепатопротекторному действию мексидол. 6 табл.

β-Гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид формулы

проявляющий антиоксидантную, гепатопротекторную и иммуномодулирующую активность.