СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2005 года по МПК A61K41/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в эксперименте для повышения иммуногенности антигенов.

Повышение иммуногенности антигенов является актуальной задачей современной иммунологии. Различные методы предусматривают оптимизацию схем иммунизации, конъюгацию антигенов с различными веществами, использование известных адъювантов. Однако, поскольку нагрузка ксенобиотиками является нежелательной, разрабатывается направление, связанное с введением антигенов, обработанных различными физическими факторами.

Известен способ иммунизации эритроцитами барана (Горяйнов И.И. // Акт. вопросы мед. науки. Сб. науч. тр., посв. 60-летию КГМУ, Курск. 1997. С.96-100), включающий оценку специфического иммунного ответа после его индукции с помощью введения эритроцитов барана лабораторным животным. Иммунизация эритроцитами барана осуществляется после введения «тяжелой» фракции аутологичных эритроцитов, обработанных КВЧ-излучением.

Известен способ иммунизации эритроцитами барана (Сипливая Л.И., Ласкова И.П. // Акт. вопросы мед. науки. Сб. науч. тр., посв. 60-летию КГМУ, Курск. 1997. С.201-209) с возможностью усиления под действием введения старых («тяжелых») аутологичных эритроцитов, обработанных ультрафиолетовым облучением, перед иммунизацией гетерологичными эритроцитами.

Известен способ иммунизации эритроцитами барана (Князева Л.И., Конопля Е.Н., Горяйнов И.И. // Акт. вопросы мед. науки. Сб. науч. тр., посв. 60-летию КГМУ, Курск. 1997. С.102-108), выбранный нами в качестве прототипа. Способ заключается в том, что для иммунизации применяют эритроциты барана после введения искусственно состаренных под действием магнитно-лазерного облучения аутологичных эритроцитов.

Известные способы иммунизации эритроцитами барана обладают определенными преимуществами над теми, где используются адъюванты и конъюгация с различными веществами, так как в первом случае исключается нагрузка ксенобиотиками.

Однако, известные способы усиления иммуногенности с помощью КВЧ, ультрафиолетового и магнитно-лазерного облучения предполагают введение животным аутологичных старых («тяжелых») эритроцитов, обработанных этими воздействиями, и связаны с дополнительными операциями, включающими взятие аутологичных эритроцитов, выделение из них «тяжелой» фракции, ее обработки физическими факторами и введение животным.

Целью изобретения является усиление индукции первичного иммунного ответа у экспериментальных животных.

Поставленная цель достигается тем, что эритроциты барана обрабатывают переменным магнитным полем 50 Гц, 25 мТл в течение 30 минут и иммунизируют интактных животных внутрибрюшинно по 0,5 мл на 100 г массы.

Изобретение «Способ стимуляции иммунного ответа в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины в области иммунологии при экспериментальных исследованиях средств для повышения иммуногенности антигенов.

Новизна изобретения заключается в том, что эритроциты барана обрабатывают переменным магнитным полем (ПеМП) 50 Гц, 25 мТл, 30 минут и иммунизируют интактных животных внутрибрюшинно по 0,5 мл на 100 г массы.

Известно, что эритроциты различных видов животных обладают структурно-функциональным сходством, поэтому мы применяем обработку физическим фактором (ПеМП) эритроцитов барана с последующей оценкой первичного иммунного ответа на них. Отмечается статистически значимая стимуляция первичного иммунного ответа на омагниченные эритроциты, о чем можно судить по повышению количества спленокариоцитов, уровня клеток-антителопродуцентов и продукции антиэритроцитарных антител (гемолизинов) у опытных животных по сравнению с контрольными. Это подтверждается результатами морфологического исследования лимфоидных органов животных обеих групп, демонстрирующими преимущество, полученное в опытной группе.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при проведении исследований в области повышения иммуногенности антигенов, в научно-исследовательских институтах и учреждениях иммунологического профиля.

Приводим результаты экспериментов по изучению действия ПеМП на иммуногенность эритроцитов барана в опытной группе животных по сравнению с контрольной группой, где иммунизацию проводили необработанными эритроцитами барана. Опыт по изучению действия ПеМП на иммуногенность эритроцитов барана (ЭБ) ставили на 32 белых крысах-самцах массой 150-200 г, находящихся в стандартных условиях вивария. Опыт ставили следующим образом: 5% ЭБ обрабатывали ПеМП (50 Гц, 25 мТл, 30 мин) на генераторе «Градиент-1» и иммунизировали интактных крыс внутрибрюшинно по 0,5 мл на 100 г массы (опытная группа). Контрольных животных иммунизировали аналогичным образом необработанными ЭБ. На 5-е сутки животных всех групп декапитировали. Из 0,5 селезенки готовили суспензию, в которой подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК), кроме того, определяли уровень антителообразующих клеток (АОК) методом прямого локального гемолиза (Cunningham A.J., 1964). В сыворотках животных после декомплементирования при 56°С в течение 30 мин изучали титры антиэритроцитарных антител с помощью реакции комплементзависимого гемолиза. Количество ЯСК рассчитывали на 1 мл взвеси клеток, количество АОК - на селезенку, титры антител выражали в десятичных логарифмах (lg). Оставшуюся половину селезенки, тимусы и мезентериальные лимфатические узлы использовали для морфологических исследований, которые проводили следующим образом. После предварительной фиксации и проводки целлоидин-парафиновые срезы (6-7 мкм) этих органов окрашивали: 1) для обнаружения структурных изменений - гема-токсилин-эозином; 2) с целью выявления нуклеопротеидов - по Браше в модификации Р.А.Симаковой (1960); 3) для выявления гликоза-миногликанов - по А.Л.Шабадашу, Steedman в модификации Mowry (1956), по М.Г.Шубичу, Г.М.Могильной (1979). Проводили морфометрическое исследование лимфоидных органов, которое осуществляли с помощью стандартной окулярной сетки Автандилова; плотность лимфоклеточной популяции в срезах тимуса определяли в 30 полях зрения площадью 4000 мкм².

Табл. 1 и 2 иллюстрируют результаты опыта: в табл.1 представлено содержание ЯСК и АОК, а также уровня гемолизинов у животных, иммунизированных интактными и омагниченными эритроцитами барана.

Таблица 1
Влияние обработки эритроцитов барана ПеМП на индукцию первичного иммунного ответа у крысГруппы животныхВоздействиеКоличество ЯСК в селезенке (×10⁶)Количество АОК в селезенке (×10³)Уровень гемолизинов (lg титров)Контрольная (n=17)Иммунизация интактными эритроцитами108,9±5,1712,4±1,951,54±0,122Опытная (n=15)Иммунизация эритроцитами, обработанными ПеМП (50 Гц 25 мТл)137,8±10,3*23,3±3,47*1,87±0,054*Примечание. * - статистически достоверные отличия от контроля (Р<0,05)

Отмечается статистически значимая стимуляция первичного иммунного ответа на омагниченные эритроциты, о чем можно судить по повышению количества спленокариоцитов, уровня АОК и продукции антиэритроцитарных антител (гемолизинов) у опытных животных по сравнению с контрольными. Это подтверждается результатами морфологического исследования лимфоидных органов животных обеих групп. Так в опытной группе у большинства крыс в микрокартине центральных и периферических органов иммунной системы наблюдались показатели, соответствующие высокой или умеренно-повышенной функциональной активности. Например, в тимусе активация лимфоидной ткани выражалась в увеличении размеров долек и их коркового вещества, повышении плотности лимфоклеточной популяции (особенно коркового слоя) и высоком содержании митотически делящихся пиронинофильных широкоплазменных иммунобластов в субкапсулярной зоне долек. В периваскулярной зоне междольковой соединительной ткани тимуса обнаруживались плазматические и тучные клетки, последние нередко в состоянии дегрануляции. Эти же клетки были выявлены в дольках тимуса, где отмечались их контакты с кортикальными тимоцитами. В Т-зависимых зонах периферических лимфоидных органов (периартериальных муфтах селезенки и паракортикальных зонах мезентериальных лимфатических узлов), а также в фолликулах лимфоузлов большинства животных опытной группы также наблюдались признаки активации лимфоидной ткани, в частности, наличие большого числа (3 и более в поле зрения) фолликулов крупных и средних размеров, большинство - с герминативными центрами, содержащими пиронинофильные (богатые нуклеопротеидами) митотически делящиеся лимфобласты, а также макрофаги и дендритные клетки (антиген-презентирующие), интенсивно окрашивающиеся при выявлении гликозаминогликанов. В красной пульпе селезенки (чаще в синусах и вокруг артериол) наблюдались макрофагально-лимфоцитарные комплексы, в большинстве которых присутствовали гиперхромные, т.е. характеризующиеся высокой функциональной активностью лимфоидные элементы, что может рассматриваться как признак выраженной межклеточной кооперации, развивающейся в ходе иммунного ответа. Синусы лимфатических узлов заполнены лимфоидными, плазмоцитарными, активированными макрофагально-ретикулярными элементами, отмечалось наличие тучных клеток.

В контрольной группе животных изученный спектр морфологических показателей в целом соответствовал умеренному или умеренно-повышенному уровню функциональной активности органов иммунной системы, однако следует отметить несколько меньшую степень их выраженности по сравнению с описанной выше у крыс опытной группы, о чем свидетельствуют данные морфометрии, представленные в табл. 2.

Таблица 2
Структурная характеристика тимуса животных опытной и контрольной группГруппа животныхОтносительная площадь, у.е.Плотность расположения лимфоидных клетокКорковое веществоМозговое веществоКорковое веществоМозговое веществоКонтрольная31,56±1,8527,28±2,21160,5±3,3104,8±1,5Опытная42,46±2,3*36,32±1,68*175,8±3,32*109,0±2,27Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей контрольной группы (Р<0,001)

Обнаруженные статистически значимые различия (Р<0,001) по площади коркового и мозгового вещества тимуса и плотности лимфоклеточной популяции в корковом веществе долек говорят о более активном состоянии иммунной системы у животных опытной группы по сравнению с контрольной.

Итак, нами получены данные о повышении иммуногенности гетерологичных эритроцитов при действии на них переменного магнитного поля, вероятно, за счет изменения под влиянием омагничивания их поверхностных структур, играющих роль антигена. При проведении магнитобиологических исследований у ПеМП были неоднократно выявлены мембранотропные свойства (Аксенов С.И., 1997; Шихлярова А.И. и соавт., 1998; Бордюшков Ю.Н. и соавт., 2000). Возможно, именно изменение свойств клеточных мембран эритроцитов под влиянием ПеМП приводит к обнаруженному нами эффекту.

Технико-экономическая эффективность «Способа стимуляции иммунного ответа в эксперименте» заключается в повышении иммуногенности гетерологичных эритроцитов при действии на них переменного магнитного поля, вероятно, за счет изменения под влиянием омагничивания их поверхностных структур, играющих роль антигена. Об отмеченной статистически значимой стимуляции первичного иммунного ответа на омагниченные эритроциты можно судить по повышению количества спленокариоцитов, уровня антителообразующих клеток и продукции антиэритроцитарных антител у опытных животных по сравнению с контрольными, что подтверждается результатами морфологического исследования лимфоидных органов животных обеих групп. Обнаруженные статистически значимые различия (Р<0,001) по площади коркового и мозгового вещества тимуса и плотности лимфоклеточной популяции в корковом веществе долек говорят о более активном состоянии иммунной системы у животных опытной группы по сравнению с контрольной.

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для стимуляции иммунного ответа в эксперименте. Сущностью изобретения является иммунизация интактных животных эритроцитами барана, обработанными переменным магнитным полем 50 Гц, 25 мТл в течение 30 минут. Техническим результатом является усиление индукции первичного иммунного ответа у экспериментальных животных. 2 табл.

Способ стимуляции иммунного ответа в эксперименте, включающий иммунизацию эритроцитами барана, отличающийся тем, что эритроциты барана обрабатывают переменным магнитным полем 50 Гц 25 мТл в течение 30 мин и иммунизируют интактных животных внутрибрюшинно по 0,5 мл на 100 г массы.