Способ супрессии иммунного ответа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/80 G01N33/48 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для подавления формирования гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных,

Известно применение имммунодепрес- сивных средств, например циклофосфана, азатиоприна, 5-фторурацила, метотрексата в качестве препаратов, подавляющих формирование ГИО.

Однако применение иммунодепрессив- ных средств вызывает нежелательные побочные эффекты, в том числе лейкопению, лимфопению, агранулоцитоз, нарушение функции печени.

Известно влияние инъекции папаина на иммунологическую реактивность больных остеохондрозом позвоночника.

Однако при введении протеолитических ферментов (папаина) могут наблюдаться отрицательные побочные эффекты: изменение свертываемости крови, аллергические реакции.

Целью изобретения является повышение физиологичности способа за счет снижения побочных эффектов.

Цель достигается тем, что животным перед иммунизацией трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2108 клеток на 100 г массы тела вводили сингенные эритроциты, предварительно прогретые в течение 15 мин при 42°С и обработанные папаином в дозе 10 мкг. Первую инъекцию при трехкратном введении сингенных эритроцитов проводили в день введения сенсибилизирующей дозы антигена.

Для изучения развития ГИО антиген, например эритроциты барана (ЭБ), вводили в дозе (1,9-2,1) 10 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней после введения антигена животных умерщвляли под эфирным наркозом и в селезенке определяли количество клеток, образующих антитела к ЭБ (АОК), и клеток, образующих розетки с ЭБ (РОК).

Для изучения ГЗТ сенсибилизирующую дозу эритроцитов (106 клеток в 0,3 мл

Ё

|

со ч

к

0,15 М хлористого натрия) вводили внутри- брюшинно. Через 4 суг вводили разрешающую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия) в подушечку правой лапки задней конечности. В подушечку левой лапки вводили 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия. Выраженность ГЗТ определяли через сутки после введения разрешающей дозы ЭБ по разнице веса и количества кар- риоцитов регионарного и контралатераль- ного лимфатических узлов.

Наибольшим иммуносупрессорным эффектом обладают сингенные эритроциты, прогретые 15 мин при 42°С, обработанные папаином (доза 10 мкг) и введенные трехкратно, внутрибрюшинно, в разовой дозе 2- 108 клеток на 100 г массы тела.

П р и м е р 1. Эритроциты интактных крыс обрабатывали папаином по следующей схеме: к, 15 мл осадок эритроцитов (25-108 клеток) добавляли 1 мл раствора фармацевтического препарата папаина, содержащего 10 или 50 мкгактивного вещества, и инкубировали в термостате при 37°С в течение 3 ч, встряхивая каждые 0,5 ч. Затем эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин, Сингенные эритроциты, обработанные папаином, вводили однократно или трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно вдозе2 108 клеток на 100 гмассы тела здоровым крысам. В последний день введения сингенных эритроцитов животных внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ в дозе 2-Ю8 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней курс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК. О степени подавления иммунного ответа судили по сравнению с соответствующими показателями контрольных групп животных, получивших однократные или трехкратные инъекции нативных эритроцитов.

Для изучения ГЗТ сингенные эритроциты, обработанные раствором папаина, содержащего 10 или 50 мкг активного вещества, вводили однократно или трехкратно внутрибрюшинно с интервалом 24 ч в дозе 2-108 клеток на 100 г массы тела здоровым крысам. В первый день введения сингенных эритроцитов животным внутрибрюшинно вводили сенсибилизирующую дозу ЭБ (106 клеток в 0,3 мл 0,15 М хлористого натрия). Через 4 сут в подушечку правой лапки задней конечности вводили разрешающую дозу эритроцитов барана (108 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия). В подушечку левой лапки вводили 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия. О выраженности ГЗТ судили через сутки после введения разрешающей дозы ЭБ по разнице веса и

количеству ядросодержащих клеток регионарного и контралатерального лимфатических узлов.

Установлено, что как однократное, так и

трехкратное введение нативных зритроци- тов, обработанных папаином в дозах 10 или 50 мкг, не приводит к достоверному изменению показателей ГИО и ГЗТ по сравнению с группами животных, получавших инъек0 ции нативных необработанных эритроцитов (табл.1).

П р и м е р 2. Эритроциты интактных крыс прогревали в термостате по следующей схеме: 0,15 мл осадка эритроцитов

5 взвешивали в 1 мл среды 199 и прогревали 15 мин при 42°С. После прогревания эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин.

0Для изучения развития ГИО сингенные

прогретые эритроциты вводили однократно или трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2108 клеток на 100 гмассы тела здоровым крысам. В последний день

5 введения сингенных эритроцитов животных внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ в дозе 2-108 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней крыс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК. О степени по0 давления иммунного ответа судили по сравнению с соответствующими показателями контрольных групп, получавших однократно или трехкратно инъекции нативных эритроцитов. Для изучения влияния на раз5 витие ГЗТ сингенные прогретые эритроциты вводили однократно или трехкратно внутрибрюшинно с интервалом 24 ч, в дозе 210 клеток на 100 г массы тела здоровым крысам.

0В первый день введения сингенных

эритроцитов животным внутрибрюшинно вводили сенсибилизирующую дозу ЭБ (10 клеток в 0,15 мл хлористого натрия). Через 4 сут в подушечку правой лапки задней ко5 нечности вводили разрешающую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия). Напряженность ГЗТ определяли через сутки после введения разрешающей дозы эритроцитов по разнице веса

0 и количества карриоцитов регионарного и контралатерального лимфатических узлов. О степени подавления развития ГЗТ судили по сравнению с соответствующими показателями групп животных, получивших инъек5 ции нативных эритроцитов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение сингенных прогретых эритроцитов не влияет на развитие ГИО и ГЗТ по сравнению с контрольными группами (табл.1).

П р и м е р 3. Эритроциты интактных крыс прогревали в термостате по схеме (см. пример 2), трижды отмывали физиологическим раствором, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин. Затем про- гретые эритроциты обрабатывали раствором папаина, содержащего 10 или 50 мкг активного вещества по схеме (см. пример 1).

Выраженность ГИО оценивали по количеству АОК в селезенке по сравнению с со- ответствующими показателями групп животных, получивших нативные эритроциты, сингенные эритроциты, обработанные папаином, или эритроциты, подвергнутые прогреванию. О напряженности ГЗТ судили по разнице веса и количеству карриоцитов регионарного и контралатерального лимфатических узлов по сравнению с контрольными группами.

При использовании предлагаемой мо- дели следует избегать изменения доз папаина, т.к. низкая доза папаина 0,1 и 1 мкг не вызывает иммуносупрессорного эффекта; высокая доза папаина 100 и 150 мкг в отдельных случаях может вызвать стимуля- цию иммунного ответа за счет пирогенного эффекта (1,2-1,5% случаев).

Перегревание эритроцитов (45° 15 мин или 42° 25 мин) вызывает значительный гемолиз эритроцитов и, к&. следствие, отсут- ствие иммуносупрессорного эффекта (табл.2). Эффективность предлагаемой моУсловия опыта

АОК,

тыс/орган

дели супрессии иммунного ответа 98- 98,5%.

Таким образом установлено, что максимальный иммуносупрёссорный эффект наблюдается при трехкратном введении сингенных прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг (табл.1).

Результаты исследования показали, что трехкратное введение прогретых сингенных эритроцитов, обработанных папаином, ингибирует не только развитие ГИО, но в значительно большей степени угнетает развитие ГЗТ, что может способствовать значи- тельному подавлению аллергических процессов в организме. Способ угнетения формирования иммунного ответа не вызывает вредных побочных эффектов, прост в исполнении, не токсичен и стабилен в получении результатов.

Формула изобретения Способ супрессии иммунного ответа путем введения в организм животного имму- нодепрессанта, отличающийся тем, что, с целью повышения физиологичное™ способа за счет снижения побочных эффектов, в качестве иммунодепрессанта используют сингенные эритроциты, предварительно обработанные папаином в дозе 10 мкг на 0,15 мл осадка эритроцитарной массы, причем эритроциты вводят внутрибрюшинно трехкратно с суточным интервалом.

Т а б. л и ц а 1

т

РОК, млн/орган

Разница массы,JРазница количест- |мгва кариоцитов

Использование: медицина, биология для подавления формирования гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных. Сущность изобретения: трехкратно внутрибрюшинно вводят сингенные прогретые эритроциты, обработанные папаином в дозе 10 мкг. 2 табл.

Контроль (без введения натив- ных эритроцитов)

Однократное введение нативных эритроцитов

Трехкратное введение нативных эритроцитов

Однократное введение эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг

Трехкратное введение эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг

Однократное введение эритроцитов, обработанных папаином в дозе 50 мкг

Трехкоатное введение зритроци тов,обработанных папаином в дозе 50 мкг

Однократное введение прогретых эритроцитов

Трехкратное введение прогретых эритроцитов

Однократное введение прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг

25,7+2,441,5±4,97,2+1,6Э,7±2,1

27,1±3,244,СИЗ,37,4+1,89,5±1,9

28,3+3,,615,77,7±1,6 . 10,3±2,4

24,0+2,540,2+4,67,0+1,39,4+2,4

23,6±2,439,7±4,17,1+1,58,8+1,8

25,1+ ,0,29,6±4,76,9+1,810,1±1,9

26,2Ј3,141,8+5,17,3±2,09,1+1,2

26,5+3,042,814,37,5±1,410,,2

27,8±3,343,4±4,57,6+1,69,4±1,7

18,5+2,,5+3,.3+0,,6+1,2

Условия опыта

, -х10,6+1,4 18,4+2, 1,710,5

21,2+1,9 35,313,1 6,Ц1,2

20,1±1,8 31, it2,9 5,2+1,4

Примечание. 1. Калдая средняя получена на 10 крысах.

27,3+3, Ь М, 3+6,1 7;9+2,1

26,8+it,6 2,8+6,4 7,8+2,8

37,8iЈ, 58,916,1 8,8+2,4 (1,5% случаев)

39,4+5,8 (121 случаев)

61,2+6,0 9,2+3,1

26,8+2,8 44,6+5,1 7,0+1,4

Продолжение табл.1

Г7

РОК, Разница массы, Разница количест- млн/оргач | мгва кариоцитов

18,4+2, 1,710,5

35,313,1 6,Ц1,2

31, it2,9 5,2+1,4

2,610,9

7,3 + 1,8

,6,Hi,7

11,2+2,6

10,8+3,1

16,814,1

61,2+6,0 9,2+3,1

17,9+4,1

10,1+3.1