СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИБУНОЛА ИЗ БИООБЪЕКТОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/15 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к судебно-медицинской экспертизе при определении дибунола в тканях и биожидкостях, а также при определении фармакодинамики в различных лекарственных формах. Прототипом предлагаемого изобретения является фармакодинамика дибунола в крови и тканях крыс после однократного введения (см. Матвеева С.А. Фармакокинетика нового противоопухолевого препарата - дибунола. Автореф. Дисс. канд. Биол. Наук, Черноголовка, - 1982, - 25 с. По данному способу выделение дибунола из биологических сред осуществляется экстракцией диэтиловым эфиром в реконструированном приборе типа Сокслета. Количественное определение дибунола в образцах определяется на газожидкостном хроматографе "Хром-31" с пламенно-ионизационным детектором при использовании наполнительной колонки с неподвижной фазой Апиезон L в количестве 13 вес.%. На силанизированном хромосорбе W. Температура термостатирования колонки 180^o, объем пробы 1-2 мкл. Чувствительность метода -4•10^-9 г дибунола, воспроизводимость ±10%.

Недостатком данного способа является использование сложной аппаратуры, что является следствием его сложности и низкой воспроизводимости и чувствительности.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа и повышение его воспроизводимости, а также чувствительности. Данная цель достигается тем, что зкстракция при определении дибунола из биообъектов осуществляется изопропиловым спиртом в колбе с обратным холодильником на водяной бане с последующим хроматографированием в тонком слое сорбента с использованием системы растворителей хлороформ - ацетон (9:1) и спектрофотометрическим определением.

Способ определения дибунола из тканей осуществляют следующим образом. Биообъект помещают в сухую химическую колбу емкостью 100 см³ в количестве 1 мл и прибавляют 50 мл изопропилового спирта, перемешивают стекляной палочкой и ставят на водяную баню. Колбу закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию при 80^oC в течение экспериментально установленного времени для каждого биологического объекта следующим образом. Способ определения времени экстракции дибунола из биообъектов осуществляют следующим образом. В сухую химическую колбу емкостью 100 см³ помещают 3 мл гомогената биообъекта (1,0 г исследуемого органа и 3 мл физиологического раствора), прибавляют 50 мл изопропилового спирта, перемешивают стеклянной палочкой и ставят на водяную баню. Колбу закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию дибунола из каждого биологического объекта при 80^oC в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 часов.

После каждого часа экстракции вытяжку в изопропиловом спирте охлаждают при комнатной температуре и обезвоживают 5,0 г сульфата меди (предварительно прокаленным). Обезвоженный раствор фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента", в сухой химический стакан емкостью 50 см³ и фотометрируют на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. На основании полученных данных время экстракции дибунола из биообъектов определяют по максимальному значению интенсивности оптической плотности. Время экстракции дибунола из биологических объектов: в плазме соответствует 5 часам; в печени - 4 часам; в почках - 3 часам; в сердце - 2 часам; в мозговой ткани - 4 часам; в подкожной жировой клетчатке - 3 часам.

Экстракт охлаждают при комнатной температуре и обезвоживают 5 г меди сульфата (предварительно прокаленным). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" в сухой химический стакан емкостью 50 см³, в сухую выпарительную чашку емкостью 25 см³ помещают 5 мл фильтрата и выпаривают на водяной бане до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилового спирта 96%. Проводят хроматографическое определение в тонком слое сорбента, которое осуществляется следующим образом. Стеклянным капилляром наносят исследуемый раствор на линию старта хроматографической пластинки марки "Сорбфил" и параллельно наносят "свидетель" - 0,5% раствор дибунола в этиловом спирте. Пластинку хроматографируют в системе растворителей хлороформ - ацетон (9:1), пробег фронта растворителей 10 см. После подсушивания на воздухе пластинку рассматривают в ультрафиолетовом (УФ) свете, на участках с исследуемым раствором наблюдают флюоресцирующие пятна. Пластинку проявляют в парах йода, на участке с исследуемым раствором наблюдают окрашенные пятна желтого цвета с R_f = 0,9. На проявленных пластинках отмечают пятна и элюируют. Элюат помещают в сухой химический стакан емкостью 25 см³ и растворяют в 5 мл этилового спирта 96%, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит опыт интактных животных, который подготовлен к анализу аналогичным образом.

На основании полученных данных оптической плотности вычисляют концентрацию дибунола в биообъектах по формуле:
C = D/E^1% _1см • 10/1000, где
C - концентрация дибунола в биообъекте (%);
D - данные оптической плотности;
E^1% _1см - удельный показатель поглощения, равный 101,5.

Чувствительность -0,89•10^-9 г дибунола, воспроизводимость ± 4,16%.

Пример 1. Способ определения дибунола из биообъекта (плазмы) осуществляют следующим образом. Биообъект - плазму помещают в сухую химическую колбу емкостью 100 см³ в количестве 1 мл, и прибавляют 50 мл изопропилового спирта, перемешивают стеклянной палочкой, и ставят на водяную баню. Колбу закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию при 80^oC, в течение 5 часов - экспериментально установленного времени. Экстракт охлаждают при комнатной температуре и обезвоживают 5,0 меди сульфата (предварительно прокаленным). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" в сухой химический стакан емкостью 50 см³ в сухую выпарительную чашку емкостью 25 см³ помещают 5 мл фильтрата и выпаривают на водяной бане до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилового спирта 96% и стеклянным капилляром наносят на линию старта хроматографической пластинки марки "Сорбфил". Параллельно наносят "свидетель" - 0,5% раствор дибунола в этиловом спирте. Пластинку хроматографируют в системе растворителей хлороформ - ацетон (9:1), пробег фронта растворителей 10 см. После подсушивания на воздухе пластинку рассматривают в УФ - свете, на участках с исследуемым раствором наблюдают флюоресцирующие пятна. Пластинку проявляют в парах йода, на участке с исследуемым раствором наблюдают окрашенные пятна желтого цвета с R_f = 0,9. На проявленных пластинках отмечают пятна простым карандашом и элюируют. Элюат помещают в сухой химический стакан емкостью 25 см³ и растворяют в 5 мл этилового спирта 96%, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит интактный опыт, который подготовлен к анализу аналогичным образом:
На основании полученных данных оптической плотности вычисляют концентрацию дибунола в плазме по формуле
C = D/E_1см ^1% • 10/1000, где
C - концентрация дибунола в плазме (%),
D - данные оптической плотности;
E_1см ^1% - удельный показатель поглощения, равный 101,5.

Пример 2. Способ определения дибунола из биообъекта (сердца) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей сердца проводят в течение экспериментально установленного времени - 2 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Пример 3. Способ определения дибунола из биообъекта (мозговой ткани) проводится по методике примера 1. Экстракцию дибунола из мозговой ткани проводят в течение экспериментально установленного времени - 4 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Пример 4. Способ определения дибунола из биообъекта (печени) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей печени проводят в течение экспериментально установленного времени - 4 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообьекте.

Пример 5. Способ определения дибунола из биообъекта (почек) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей почек проводят в течение экспериментально установленного времени - 3 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Пример 6. Способ определения дибунола из биообъекта (подкожной жировой клетчатки) проводят по методике примера 1. Экстракцию дибунола из тканей подкожной жировой клетчатки проводят в течение эспериментально установленного времени - 3 часа, что соответствует его максимальному содержанию в данном биообъекте.

Данное изобретение было апробировано на белых беспородных крысах-самцах для определения дибунола в тканях и биожидкостях. Концентрация дибунола определялась в биообъектах на животных со спровоцированными заболеваниями и в сравнении с контрольной группой. Опытным животным дибунол вводился перорально в виде таблеток из расчета 50 мг/кг, и был обнаружен в максимальном количестве в плазме к 2 часу после введения 3,48•10^-6 мкг и ректально в виде суппозиториев из расчета 50 мг/кг, и был обнаружен в максимальном количестве в плазме к 1 часу после введения 4,14•10^-6 мкг. Дибунол был обнаружен для последующего определения распределения его в органах при различных путях введения, что имеет исключительно важное значение при судебно-медицинской экспертизе и изучения методов лечения различных заболеваний, их коррекции, титрования дозы - гастродуоденальных язв, гепатитов, колитов, профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и применения в дерматологической практике.

Предложенный метод по сравнению с прототипом является доступным, более чувствительным -0,89•10^-9 г дибунола, воспроизводимым ± 4,16%, точным, экономичным, простым в исполнении в связи с использованием несложного оборудования (колбы с обратным холодильником, водяной бани, хроматографической камеры, хроматографических пластинок марки "Сорбфил" и спектрофотометра), доступных и недорогих реактивов (спирт этиловый, спирт изопропиловый, хлороформ ацетон, сульфат меди).

Способ может быть использован в области медицины, а именно в судебно-медицинской экспертизе при определении дибунола в тканях и биожидкостях, а также при определении фармакодинамики в различных лекарственных формах. Определяют время экстракции дибунола из биообъектов путем экстракции изопропиловым спиртом в колбе с обратным холодильником на водяной бане с последующим хроматографированием в тонком слое сорбента с использованием системы растворителей хлороформ - ацетон (9:1), проявляют в парах иода, элюируют этиловым спиртом, спектрофотометрируют при длине волны 276 нм. Концентрацию дибунола рассчитывают по формуле С = Д/Е^1% _1см • 10/1000, где С - концентрация дибунола в плазме, %, Д - данные оптической плотности; Е^1% _1см - удельный показатель поглощения, равный 101,5. Способ является доступным, более чувствительным, точным, экономичным и простым в исполнении.

Способ определения дибунола из биообъектов, включающий экстракцию, хроматографирование, отличающийся тем, что определяют время максимальной экстракции дибунола из биообъекта путем экстракции в изопропиловом спирте и спектрофотометрирования, вытяжку, полученную при максимальном времени экстракции, обезвоживают, фильтруют, выпаривают, растворяют в этиловом спирте и хроматографируют в тонком слое сорбента с использованием системы растворителей хлороформ - ацетон (9 : 1), проявляют в парах йода, элюируют этиловым спиртом, измеряют оптическую плотность при длине волны 276 нм и концентрацию дибунола рассчитывают по формуле
С = D/E_1см ^1% • 10/1000,
где С - концентрация дибунола в биообъекте, %;
D - данные оптической плотности;
E_1см ^1% - удельный показатель поглощения, равный 101,5.