ШТАММ "ВНИВИП-ДЕП" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА КУР Российский патент 2000 года по МПК C12N7/00 A61K39/15 A61K39/12 G01N33/569 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а точнее к производству вакцинных препаратов против реовирусного теносиновита кур, и может быть применимо для изготовления диагностических препаратов.

Важным средством борьбы против реовирусного теносиновита кур, заболевания, причиняющего значительный ущерб промышленному птицеводству, является вакцинопрофилактика. Технология производства вирусвакцины предусматривает лиофилизацию препарата, поэтому штаммы должны обладать выраженной устойчивостью к температурным воздействиям.

В качестве прототипа выбран Штамм "S 1133" [1].

Штамм "S 1133" выделен из сухожилия сгибателей пальцев 7-недельного бройлера при остром течении теносиновита. На хориоаллантоисной оболочке SPF - куриных эмбрионов 9 -10-суточного возраста штамм вызывает образование сероватых бляшек, гибель зараженных куриных эмбрионов и клиническое проявление болезни у цыплят с морфологическими изменениями в сухожилиях пальцевых сгибателей. Штамм формирует внутри цитоплазматические вирусные частицы с двойным капсидом диаметром около 70 нм. От зараженных кур вирус передается с инкубационным яйцом в течение 8-12 дней после заражения.

Штамм вызывает цитопатический эффект в культуре куриных фибробластов [2] . Физико-химические, биологические и морфологические признаки прототипа представлены в таблице. 1.

В зарубежной практике указанный штамм используется для производства вакцин против теносиновита кур [3] . Его культивируют в культуре клеток SPF-эмбрионов кур. Однако получение SPF- эмбрионов требует больших материальных затрат. Штамм обладает остаточной реактогенностью. Высокая иммуногенная активность прототипа проявляется при его подкожном (индивидуальном) введении. Применение изготовленной из этого штамма вакцины другими способами: с питьевой водой, на конъюнктиву глаза или слизистую носа, - обеспечивает низкую защиту от контрольного заражения.

Целью изобретения является получение вакцинного штамма реовируса теносиновита кур, обладающего повышенной иммуногенной активностью независимо от способа применения, в сочетании со способностью к высокому уровню репродукции в культуре клеток, отсутствием реактогенности и сохранением повышенной термоустойчивости.

Поставленная цель достигается штаммом "ВНИВИП-ДЕП". Штамм депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов под номером "ВНИВИП-ДЕП".

Вакцинный штамм "ВНИВИП-ДЕП" получают методом перемежающихся пассажей на развивающихся куриных эмбрионах и в культуре куриных фибробластов.

Штамм аттенуирован, вызывает образование бляшек на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов, не индуцирует заболевание у цыплят и лабораторных животных при парэнтеральном введении в дозах, в 100 раз превышающих вакцинальную. Штамм не обладает гемагглютинирующей и гемадсорбирующей активностью, имеет антигенное родство с эпизоотическими штаммами реовируса, вызывающими заболевание птиц в птицеводческих хозяйствах и штаммом "S 1133"
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА "ВНИВИП-ДЕП"
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Вирионы являются сферическими, кубической симметрии, с размером 65-70 нм, нуклеокапсид содержит РНК.

ПАТОГЕННОСТЬ ДЛЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ И ЦЫПЛЯТ
В опытах по определению патогенности заявляемого штамма использовали 7-11-суточные куриные эмбрионы и цыплят 1-10-суточного возраста. Инфицирование проводили в желточный мешок 7-8-суточных и в аллантоисную полость 9-11-суточных эмбрионов в дозах 100 и 1000 ЭИД₅₀ в 0,2 см³, а цыплят заражали подкожно, энтерально и в подушечку стопы в дозе 10000 ЭИД₅₀/0,2 см³. Эмбрионы инкубировали в течение 5 сут при температуре 37^oC. За цыплятами наблюдали 40 дней.

В таблице 2 представлены результаты изучения патогенности штамма "ВНИВИП-ДЕП" для куриных эмбрионов (гибель эмбрионов, %), в таблице 3 - то же для цыплят (заболело/пало, %).

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что при инокуляции в желточный мешок штамм "ВНИВИП-ДЕП" вызывает гибель куриных эмбрионов больше на 7-20%.

При температуре 32^oC и 34^oC патогенность штамма "ВНИВИП-ДЕП" для куриных эмбрионов падает и вызывает гибель 10 и 55% инфицированных эмбрионов соответственно.

Данные таблицы 3 свидетельствуют, что штамм "ВНИВИП-ДЕП" не вызывает гибель цыплят.

РЕПРОДУКЦИЯ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК
Репродуцируется в культуре клеток куриных эмбрионов, вызывая острую форму инфекции с выраженным цитопатическим эффектом через 2-4 сут и накапливается в титрах 6,0-7,0 lg ТЦД₅₀. В культурах клеток КФ (первично-трипсинизированная культура клеток фибробластов куриного эмбриона), КП (культура клеток печени куриного эмбриона) и перевиваемых линий ВНК-21, BGM, Vero размножается. Инфекционный титр вируса в культуральной жидкости достигает 5-7 lg ТДЦ₅₀ на 4-5 сутки культивирования при 37^oC.

В культуре КФ под агаровым покрытием штамм "ВНИВИП-ДЕП" образует мелкие бляшки до 2 мм в диаметре, бесцветные с ровными краями с детритами клеток внутри.

РЕПРОДУКЦИЯ В КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ
При заражении 9-11-суточных куриных эмбрионов в аллантоисную полость и 7-8-суточных в желточный мешок титр вируса "ВНИВИП-ДЕП" на 5-е сутки составляет соответственно 6.25; 7.0 lg ЭИД₅₀ при температуре культивирования 37^oC. Вызывает образование единичных бляшек на аллантоисной оболочке со стороны воздушной камеры эмбриона, выпуклые неправильной формы, различные по величине.

ТЕРМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ
Штамм "ВНИВИП-ДЕП" термостабилен. Константа кинетики инактивации (Т/Р - снижение инфекционного титра при прогревании культуральной вируссодержащей жидкости при 56 и 60^oC в течение 60 мин) равняется 1.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ЭФИРУ И ХЛОРОФОРМУ
Штамм "ВНИВИП-ДЕП" не чувствителен к инактивирующему действию эфира и хлороформа (контакт с 20% реагентов в течение 60 мин). Константа инактивации составляет 1.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Методами РНГА, ИФА и МФА с использованием типоспецифической сыворотки к штамму "S 1133" реовируса, штамм "ВНИВИП-ДЕП" идентифицирован как реовирус теносиновита кур.

АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ
У цыплят 35-40-суточного возраста через 21 сутки после однократной энтеральной иммунизации штаммом "ВНИВИП-ДЕП" вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови содержатся в концентрации 2,0 lg ИН. У кур на 21 день после трехкратной иммунизации штаммом "ВНИВИП-ДЕП" вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови содержатся в концентрации 2,7 lg ИН или в титрах 7,3 log₂.

ИММУНОГЕННОСТЬ
У цыплят двукратно энтерально иммунизированных в 7-10- и 35-40-суточном возрасте штаммом "ВНИВИП-ДЕП" развивается резистентность к контрольному заражению в подушечку лапки патогенным штаммом "СП-73" реовируса. Иммуногенность составляет 92-95%. Максимальная сероконверсия наступает на 21 день. Титр антител в сыворотке крови составляет 1:400 - 1:800 в ИФА.

СТАБИЛЬНОСТЬ
Штамм "ВНИВИП - ДЕЛ" стабилен, его свойства сохраняются неизменными в течение 30 пассажей в культуре клеток КФ и на куриных эмбрионах.

Антигенное родство
Антигенное родство штамма "ВНИВИП-ДЕП" исследовали в отношении эпизоотических штаммов "СП-73", "М-4" и "Рос-92" и вакцинного "S 1133" в перекрестной реакции нейтрализации (таблица 4).

Экспериментальные данные свидетельствуют о полном антигенном родстве эпизоотических штаммов реовируса и прототипа "S1133".

ПРИМЕР 1.

Проверку иммуногенной активности проводили на 7-10-суточных цыплятах, не имеющих антител к реовирусу теносиновита кур, путем перорального или подкожного введения вакцинного штамма "ВНИВИП-ДЕП" в дозе 1000 ТЦД₅₀ и определения уровня специфических антител в сыворотке крови цыплят через 21 сут после прививки методом иммуноферментного анализа (ИФА) или реакции нейтрализации в культуре куриных фибробластов. Данные проверки приведены в Таблице 5.

Полученные результаты: титры не ниже 1: 400 в ИФА или 2,0 lg в реакции нейтрализации, свидетельствуют о формировании напряженного иммунитета у птиц и о высокой иммуногенной активности штамма вируса.

ПРИМЕР 2.

Опыт проводили на цыплятах 4-суточного возраста мясной породы. Цыплят заражали в подушечку лапы культуральным вируссодержащим материалом в дозе 10000 ТЦД₅₀ по 0,2 мл.

Аттенуированный штамм "ВНИВИП-ДЕП" вируса теносиновита кур поддерживали в культуре клеток куриных эмбрионов. Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани куриных эмбрионов 9-11-суточного возраста, используя в качестве ростовой среды среду Игла и среду 199 с добавлением 5-10% сыворотки крови плода коровы, пенициллина 100 ЕД/мл и стрептомицина 100 мкг/мл.

Данные опытов показали, что инкубационный период при заражении в подушечку лапы равнялся 3-4 дням. При этом обнаруживали следующие клинические признаки: угнетение, ограниченное движение, слабое поражение сустава с незначительной хромотой.

При патоморфологических исследованиях пальцевых сгибателей в области плюсны на 4 сутки после заражения отмечали отечность и утолщение дермы, мышечных пучков, стенок сухожильных влагалищ, интенсивную инфильтрацию полиморфными клетками, очаги некробиоза в хряще.

Максимальная сероконверсия наступала на 21 день. Титр антител в сыворотке составлял 1: 400 в ИФА.

ПРИМЕР 3
Опыт проводили на цыплятах 4-суточного возраста мясной породы. Цыплят заражали энтерально культуральным вируссодержащим материалом в дозе 10000 ТЦД₅₀ по 0,5 мл.

Аттенуированный штамм "ВНИВИП-ДЕП" вируса теносиновита кур поддерживали в культуре клеток куриных эмбрионов. Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани куриных эмбрионов 9-11-суточного возраста, используя в качестве ростовой среды среду Игла и среду 199 с добавлением 5-10% сыворотки крови плода коровы, пенициллина 100 ЕД/мл и стрептомицина 100 мкг/мл.

Данные опытов показали, что при энтеральном заражении клинических признаков заболевания не обнаружено.

При патоморфологических исследованиях пальцевых сгибателей в области плюсны на 4 сутки после заражения изменений не отмечали.

Максимальная сероконверсия наступала на 21 день. Титр антител в сыворотке крови составлял 1:400 в ИФА.

Заявляемый штамм "ВНИВИП-ДЕП" может найти широкое применение в промышленном птицеводстве в качестве основного компонента вакцины против реовирусного теносиновита кур. При этом выявленные свойства заявляемого штамма позволяют получить высокий уровень иммунитета при энтеральном введении препарата в отличие от широко применяемых вакцинных препаратов на основе известных штаммов, вводимых исключительно внутримышечно и подкожно.

Использованная литература
1. L. van der Heide, J Geissler, E.S. Bryant. Infektious tenosynovitis: Serologic and Histopathologic response after experimental infection with a connecticut isolate.-Avian Dis., 1974, vol. 18, n.3, p. 289-296.

2. L. van der Heide, M. Kalbac. Infectious tenosynovitis (Viral arthritis): Characterization of a connecticut viral isolant as a reovirus and evidence of viral egg transmission by reovirus-infected broiler breeders.- Avian Dis., 1975, vol. 19, n.4, p. 683-688.

3. C. S. Eidson, R. K. Page, O.J. Eleccher and I.I. Kleven. Vaccination of Broiler Breeders with a Tenosynovitis Virus Vaccina.- Poultry Science. 1979, n.58, p. 1490-1497.

Изобретение предназначено для производства вакцинных препаратов против реовирусного теносиновита кур и может быть применимо для изготовления диагностических препаратов. Штамм депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) под номером "ВНИВИП-ДЕП". Вакцинный штамм "ВНИВИП-ДЕП" получают методом перемежающихся пассажей на развивающихся куриных эмбрионах и в культуре куриных фибробластов. Вирионы являются сферическими, кубической симметрии, с размером 65-70 нм. Нуклеокапсид содержит РНК. В культуре клеток индуцирует образование бляшек размерами 1-2 мм. Репродуцируется в культуре клеток куриных эмбрионов. Вызывает острую форму инфекции с выраженным цитопатическим эффектом через 2-4 сут и накапливается в титрах 6,0-7,0 lg ТЦД₅₀. Штамм аттенуирован, вызывает образование бляшек на ХАО куриных эмбрионов. Не индуцирует заболевание у цыплят и лабораторных животных при парэнтеральном введении в дозах, в 100 раз превышающих вакцинальную. Не обладает гемагглютинирующей и гемадсорбирующей активностью. Устойчив к воздействию эфира и хлороформа. Выдерживает нагревание 60^oС в течение 60 мин. Имеет плотное антигенное родство с эпизоотическими штаммами реовируса, вызывающими заболевание в птицеводческих хозяйствах, штаммом "1133". Штамм обладает повышенной иммуногенной активностью независимо от способа применения в сочетании со способностью к высокому уровню репродукции в культуре клеток, отсутствием реактогенности и сохранением повышенной термоустойчивости. 5 табл.

Штамм вируса теносиновита кур "ВНИВИП-ДЕП" для получения вакцины против реовирусного теносиновита кур.