СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ-ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ПУСТУЛЕЗНОГО ВУЛЬВОВАГИНИТА-ГЕРПЕСВИРУСА 1 ТИПА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2004 года по МПК C12N15/38 C12Q1/68 G01N33/569 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для идентификации нуклеиновой кислоты вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита (ИРТ-ИПВ), - герпесвируса 1 типа крупного рогатого скота (BHV1), а также для решения научно-исследовательских задач по изучению этой группы вирусов.

В последние годы разрабатываются методы диагностики вирусных инфекций, которые можно объединить понятием “генодиагностика”, позволяющие обнаруживать гены или последовательности ДНК, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Следует заметить, что генетические методы разрабатываются не для того, чтобы вытеснить уже имеющиеся иммунологические и другие методы, но наоборот, чтобы их дополнить. В ветеринарной практике широко применяется в целях диагностики метод иммуноферментного анализа (ИФА) [1]. Этот метод позволяет по наличию динамики антител к инфекционному агенту судить о протекании инфекционного процесса в организме животного. Однако он представляет собой достаточно длительную процедуру, так как обычно для подтверждения анализа необходимо исследование парных сывороток, а это требует примерно 2-недельного срока, что сильно затягивает постановку диагноза и, соответственно, начало лечения. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет с высокой степенью точности быстро определять наличие вирусной ДНК.

ПЦР является прямым методом выявления вируса и имеет высокую степень чувствительности. Данный метод незаменим в ветеринарной практике (для выявления инфицированных быков-производителей, а также больных коров) [2].

В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания.

Для проведения ПЦР требуются праймеры. Это - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вирусного генома. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента, и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый термофильной ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров зависит определение строгой видоспецифичности.

Известен способ видоспецифического определения ИРТ-ИПВ (BHV1), предусматривающий амплификацию ДНК в жидкой смеси, содержащей ДНК-полимеразу, водную жидкую пробу и комбинацию праймеров, соответствующих району гена тимидинкиназы вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита (ИРТ-ИПВ) [3, прототип]. По описанию авторов, выбранные праймеры не дают перекрестных реакций в ПЦР, если для выявления ИРТ-ИПВ (BHV1) в качестве матрицы используют ДНК из клеток, инфицированных другими герпесвирусами крупного рогатого скота (BHV2, BHV3, BHV4 и PRV). Специфичность ПЦР подтверждалась рестрикционным анализом с использованием эндонуклеазы рестрикции SacII и гибридизацией продукта с вирусной ДНК. В 1994 году, когда была сделана эта работа, в международной классификации не существовало разделения между вирусами герпеса крупного рогатого скота 1-го (BHV1) и 5-го типов (BHV5) в силу высокой гомологии их геномов. Поэтому основньм недостатком описанного подхода является отсутствие дифференциации при проведении ПЦР между геномами BHV1 и BHV5.

Технической задачей изобретения является выявление ДНК герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа с высокой степенью специфичности в клинических образцах, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР.

Поставленная задача решается посредством подбора уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена UL-23 генома герпесвируса крупного рогатого скота 1-го типа, кодирующего тимидинкиназу, для которого было найдено в международных базах данных наибольшее количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов. С этой целью были проанализированы области последовательностей генома вирусов из трех уже известных в мире штаммов вируса герпеса крупного рогатого скота 1-го типа на предмет выявления консервативных районов ДНК (фиг.1), не имеющих гомологии у других герпесвирусов крупного рогатого скота с целью исключения перекрестного реагирования близких видов и типов. Был проведен компьютерный анализ кодируемых ими пептидных последовательностей с помощью программы SALIX, а с помощью компьютерной программы “OLIGO” были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции с данными праймерами.

Для выявления гомологии ДНК среди штаммов и изолятов вируса герпеса крупного рогатого скота 1 типа были проанализированы консервативные участки гена UL-23, кодирующего тимидинкиназу. Из массива базы данных “GenBank” был выбран участок гена с 1 по 1080 п.н. (по наибольшему числу сопоставимых гомологии среди ДНК различных штаммов). Этот участок гена UL-23 BHV1 был проанализирован на предмет гомологии к аналогичному участку гена UL-23 герпесвирусов 5-го типа, 2-го, 4-го и вируса болезни Ауэски (фиг.2) как самых близкородственных в подсемействе Bovine herpesviruses вирусов семейства Herpesviridae [4]. Чтобы избежать перекрестного реагирования, выбран наиболее негомологичный участок (с 16 по 236 п.н.) и к нему подобраны праймеры следующего состава:

5’-CGCGCTCTCCGCGTCGTG-3’ (18 н.)

5’-CCGCGTGCGCTCCCGTG-3’ (17 н.)

специфичные к консервативному участку вариабельной части данного гена UL-23 BHV1 (фиг.3 и 4), кодирующего тимидинкиназу.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе марки Термоцик МС 16, производитель “ДНК-технология”, г. Москва.

Продукт ПЦР был подвергнут электрофорезу в 2% агарозном геле, и о положительной реакции судили по полосе фрагмента ДНК, соответствующей размеру 221 пары нуклеотидных оснований (фиг.5).

Перечень графических материалов

Фиг.1. Сравнительное выравнивание нуклеотидных последовательностей амплифицируемого участка гена UL23 референс-штаммов BHV1 (штаммы: BHV1 - 6660, BHV1.1 - Cooper, BHV1.2 - Q3932) и референс-штамма BHV5 - N569. Выделены комплиментарные праймерам участки. Стрелками показаны направления синтеза амплифицируемого фрагмента.

Фиг.2. Сравнительное выравнивание аминокислотных последовательностей N-концевой части тимидинкиназы, кодирующей амплифицируемый район гена UL23, референс-штаммов BHV1, BHV2, BHV4, BHV5 и вируса болезни Ауэски (PRV). Выделены комплиментарные праймерам участки. Стрелками показаны направления синтеза амплифицируемого фрагмента.

Фиг.3. Нуклеотидная последовательность амплифицируемого фрагмента гена UL23 BHV1. Выделены комплиментарные праймерам участки.

Фиг.4. Рестрикционная карта амплифицируемого фрагмента BHV1 (жирным шрифтом выделены уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции)

Фиг.5. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента BHV1. Дорожки 2-11 - градиент температуры отжига 56°-65,6°С; дорожка 1 и 12 - маркер 100-1000 п.н.(СибЭнзим, Новосибирск).

Идентификация ДНК вируса герпеса крупного рогатого скота 1-го типа показана в примерах.

Пример 1. Амплификация участка ДНК гена UL23, кодирующего тимидинкиназу.

Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит: 60 мМ Tris-HCl (pH 8.5 при 25°С); 1,5 мМ MgCl₂; 25 мМ КСl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1% Тритон Х-100; 50% ДМСО; 10 мМ dNTP; 2 мкл праймеров (1 о.е. каждого); 5 мкл ДНК - матрицы (~0,1 мкг); 0,5-1 ед. Taq ДНК-полимеразы; оставшийся объем занимает вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. Все манипуляции на этапе приготовления реакционной смеси поводят на тающем льду.

Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 93°С - 1 мин, отжиг - 59° - 0,7 мин, синтез - 72° - 0,7 мин, далее 40 циклов по схеме: денатурация при 93°С в течение 0,25 мин, отжиг при 59°С - 0,7 мин, синтез при 72°С - 0,7 мин. Синтез на конечной стадии, т.е. в последнем цикле проводят при 72°С в течение 3 мин. Продукты амплификации в ПЦР анализируют электофорезом в 2% агарозном геле в стандартном Трис-Ацетатном буфере (рН 8,0) при напряжении 1 вольт на сантиметр геля.

Пример 2. Определение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита (BHV1) в образцах от больных животных.

Для апробации полученных праймеров в ПЦР использовали образцы клинического материала от больных животных с диагнозом острого инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита. От этих же больных животных исследовали парные пробы сыворотки в реакции нейтрализации в чувствительной культуре клеток. Выявили четырех- и более кратный прирост титров антител (1:16-1:128), что подтверждает наличие инфекционного процесса, вызванного вирусом ИРТ-ИПВ (BHV-1) [1]. Во всех клинических образцах (кровь и соскобы с мест повреждения) в ПЦР с патентуемыми праймерами, амплифицировался специфичный фрагмент ДНК.

Таким образом, поставленная задача по получению высоко специфичных праймеров, позволяющих выявлять ДНК ИРТ-ИПВ для проведения ПЦР из различных клинических образцов, успешно решена. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ИРТ-ИПВ (BHV-1).

Список литературы

1. Сюрин В.Н. и др. - Диагностика вирусных болезней животных. - М.: Агропромиздат, 1991.

2. Carlos Ros, Sandor Belak, - Stadies of genetik relationships between bovine, caprine, cervine and rangiferine alphaherpesviruses and improved molecular methods for virus detection and identification. - J. Clinical Microbiology, May 1999, p.1247-1253.

3. Kibenge, - F.S.B.; Harris, - L.M.; McKenna. - P.K.; Wadowska. - D.; Yason. - C.V. Amplification of strains of bovine herpesvirus 1 by use of polymerase chain reaction with primers in the thymidine kinase region. - Am-j-vet-res. Schaumburg, 111.: American Veterinary Medical Association. Sept 1994. v.55 (9) p.1206-1212.

4. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. - Частная ветеринарная вирусология. - Москва, Колос - 1979.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии. Предложены уникальные олигонуклеотиды 5’-CGCGCTCTCCGCGTCGTG-3’ (18 н.) и 5’-CCGCGTGCGCTCCCGTG-3’ (17 н.). Предложенные олигонуклеотиды позволяют проводить идентификацию нуклеиновой кислоты вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита (ИРТ-ИПВ), - гипервируса 1 типа крупного рогатого скота (BHV1). Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ИРТ-ИПВ (BHV1) в пробе. Изобретение может быть использовано в ветеринарной вирусологии и для решения научно-исследовательских задач по изучению этой группы вирусов. 5 ил.

Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выявления ДНК вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита (ИРТ-ИПВ) - герпесвируса 1 типа крупного рогатого скота (BHV1), имеющие следующий нуклеотидный состав:

5’ - CGCGCTCTCCGCGTCGTG - 3’ (18 н.)

5’ - CCGCGTGCGCTCCCGTG - 3’ (17 н.).