СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/49 G01N33/50 

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности, для определения ацетилхолина, что может найти применение для диагностики состояния холиноргических систем органов и тканей.

Известен способ определения ацетилхолина в биологических жидкостях и плазме крови, включающий обработку образца водным раствором иода на холоду, последующую обработку гидразингидратом и салициловым альдегидом в водном растворе диметилформамида, выделение полученного люминофора методом жидкостной колончатой хроматографии и флюориметрирование при длине волны 450 нм [1].

К недостаткам следует отнести то, что предлагаемым способом при определении ацетилхолина используют водный раствор иода с рН ~ 7, который способствует достаточно быстрому распаду ацетилхолина, что затрудняет точность определения и ограничивает круг исследуемых объектов, а также предлагаемым способом невозможно определить локализацию ацетилхолина.

При создании изобретения ставилась задача расширения арсенала технических средств определения ацетилхолина путем расширения круга исследуемых при определении ацетилхолина объектов.

Это достигается тем, что при определении ацетилхолина, включающем обработку анализируемой пробы реагентами иода, гидразингидрата, салицилового ангидрида, при котором о наличии ацетилхолина судят по люминесцентным характеристикам обработанной таким образом пробы, в качестве реагента иода используют спиртовый раствор иода с pH 1-3,6, причем перед обработкой гидразингидратом из пробы удаляют избыток иода, а перед обработкой салициловым ангидридом удаляют избыток гидразингидрата.

Отличительным признаком предлагаемого способа является использование для обработки пробы спиртового раствора иода с pH 1-3,6, который в отличие от водного раствора не разрушает ацетилхолин, а кислая среда стабилизирует его и этим уменьшает скорость распада, что влияет на достоверность определения и позволяет определять ацетилхолин не только в жидких средах.

Оптимальным значением pH является pH=1-3,6. При pH > 3,6 реакция образования ацетилхолиниодида практически не идет, а при pH < 1 идет кислотное разрушение пробы.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Криостатные срезы почки крысы на предметном стекле помещают в спиртовый раствор иода с pH 1 и температурой раствора 8-10^oC на 5 мин, после чего срез обрабатывают эфиром и гидразингидратом, затем обрабатывают дистиллированной водой и сушат, затем срез ткани обрабатывают салициловым ангидридом и для ускорения образования люминофора помещают в термостат на 30 мин, после чего срез обрабатывают эфиром. После вышеуказанной обработки среза ткани в нем образуется желто-оранжевый люминофор в почечных клубочках (фиг. 1), дистальных канальцах (фиг. 2) и артериях почки (фиг. 3). При микроскопии среза на люминесцентном микроскопе наблюдается интенсивность люминесценции в области 534±13 нм.

Пример 2. Аналогично примеру 1, но pH спиртового раствора иода 3,6 и время выдержки в растворе 20 мин. При микроскопии обработанного среза на люминесцентном микроскопе наблюдается интенсивность люминесценции в области 534±13 нм.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но в качестве анализируемой пробы использовали ацетилхолин с подложкой из яичного альбумина, при этом ацетилхолин растворяли в растворе яичного альбумина из расчета получить концентрацию ~ 20 нм/л. Раствор наносили на предметное стекло и высушивали. При микроскопии обработанной пробы на люминесцентном микроскопе наблюдается интенсивность люминесценции в области 534±13 нм.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но в качестве анализируемой пробы использовали пробу крови крысы с растворенным в ней ацетилхолином из расчета ~ 20 нм/л. Раствор наносили на предметное стекло и высушивали. При микроскопии обработанной пробы на люминесцентном микроскопе наблюдается интенсивность люминесценции в области 534-552 нм.

Пример 5. Аналогично примеру 1, но в качестве анализируемой пробы использовали химически чистый ацетилхолин. Полученный люминофор был отмыт метиловым спиртом и промикроскопирован, пик возбуждения люминесценции - 552 нм.

Пример 6. Аналогично примеру 1, но в качестве анализируемой пробы использовали люминофор, полученный из ацетоангидрида, который был отмыт метиловым спиртом и промикроскопирован, пик возбуждения люминесценции - 552 нм.

Результаты вышеприведенных примеров представлены на иллюстрациях. Как видно, спектры люминесценции во всех шести случаях совпадают, что свидетельствует о достоверности обнаружения предлагаемым способом ацетилхолина. Кроме того, предлагаемым способом можно определить локализацию ацетилхолина в тканях и сделать заключение об изменении его количества.

Источники информации
1. Fellman J.H. Determination of acetylcholine: Its application in study of presynaptic release and a cholineacetyltransferase assay. - J.Neurochem., 1969, v. 16, N 2, p. 135-143.

Способ может быть использован в медицине для определения ацетилхолина. Пробы обрабатывают реагентами иода, дидразингидрата, салицилового ангидрида. О наличии ацетилхолина судят по люминесцентным характеристикам обработанной таким образом пробы, в качестве реагента иода используют спиртовой раствор иода с pH 1 - 3,6, причем перед обработкой гидразингидратом из пробы удаляют избыток иода, а перед обработкой салициловым ангидридом удаляют избыток гидразингидрата. Микроскопирование проводят на люминесцентном микроскопе при длине волны 534-552 нм. Способ расширяет арсенал технических средств для определения ацетилхолина. 1 табл., 3 ил.

Способ определения ацетилхолина, включающий обработку анализируемой пробы реагентами иода, гидразингидрата, салицилового ангидрида, при котором о наличии ацетилхолина судят по люминесцентным характеристикам обработанной таким образом пробы, отличающийся тем, что в качестве реагента иода используют спиртовой раствор иода с pH 1-3,6, причем перед обработкой гидразингидратом из пробы удаляют избыток иода, а перед обработкой салициловым ангидридом удаляют избыток гидразингидрата и проводят микроскопирование обработанной пробы на люминесцентном микроскопе при длине волны 534-552 нм.